Identifizierung der Proteinspots durch die Massenspektrometrie

Die massenspektrometrische Proteinidentifikation sowie alle mit ihr verbundenen Arbeiten (bis auf die Auswertung der ESI-MS/MS-Ergebnisse) wurden von Frau Dipl. Ing. Grit Nebrich sowie Frau Andrea Koppelstätter und Frau Silke Becker durchgeführt.

Ein Massenspektrometer besteht im Prinzip aus drei Teilen, einer Ionenquelle, einem oder mehreren Analysatoren und einem Detektor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Massenspektrometer mit unterschiedlichen Ionenquellen und Analysatoren verwendet. Ein Gerät basiert auf der Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionisation (MALDI) sowie der Time of flight-Analyse (TOF) und das andere auf der Electrospray-Ionisierung (ESI) mit nachgeschalteter Ionenfalle. Vor der Analyse eines Proteinspots, muss ein Verdau der im Spot enthaltenen Proteine erfolgen.

2.2.9.1 In-Gel Verdau

Um die in den ausgeschnittenen Proteinspots enthaltenen Proteine zu identifizieren, musste zunächst ein Verdau der Proteine durch eine Protease (Trypsin) erfolgen. Hierfür wurden die Gelstücke zunächst dehydriert und dann mit einem proteasehaltigen Puffer wieder rehydriert. Auf diese Weise wurde die Protease in das Gel aufgesogen und konnte dort die Proteine spalten. Anschließend wurden die Fragmente aus dem Gel ausgewaschen. Weiterhin wurden im Rahmen des Proteinverdaus störende Chemikalien wie Salze oder Detergenzien aus den Proteinproben entfernt.

Im Detail wurden die Gelstücke zunächst dreimal mit 10 l Verdaupuffer und 10 l modifiziertem Verdaupuffer gewaschen. Danach wurden die Gelstücke in 10 l Azetonitril geschrumpft und in 2 l Proteaselösung quellen gelassen. Der Verdau fand in einem Zeitraum von 3 Stunden bei 37 °C statt. Der gewonnene Überstand wurde in eine saubere Quarzküvette überführt und die Gelstücke wurden noch zwei Mal mit je 5 l Verdaupuffer extrahiert. Die Überstände wurden gepoolt.

Im Falle einer Identifizierung der Proben mit dem MALDI-Gerät erfolgte eine Target Präparation. Zunächst wurden die Proben mit Hilfe von Poros 10 R1 Beads aufkonzentriert. Dann erfolgte die konventionelle „trockene Tropfen –Technik“. Es wurde je 1 l Matrixlösung aufgenommen und auf ein konventionelles MALDI Target transferiert.

Eine alternative Probenaufbereitungsmethode verwendet die AnchorChip® Technologie. AnchorChips® sind mit hydrophilen Patches („Anker“) in einer hydrophoben Umgebung ausgestattet, so dass der relativ hydrophile Analyt sich auf den „Ankern“ konzentriert. Ein l des gepoolten Überstands wurde auf jeden „Anker“

(386/Target) mit 400 m Durchmesser appliziert. Nachdem die Tropfen auf die Größe des „Ankers“ geschrumpft waren, wurden 0,5 l Matrixlösung zugegeben.

2.2.9.2 MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Die MALDI basiert auf der Kokristallisation der Peptide mit UV-Strahlung absorbierenden Molekülen in einer Matrix. Dabei übertragen die sauren, die UV-Strahlung absorbierenden Moleküle Protonen auf die Peptide und laden sie in den meisten Fällen positiv auf. Die Matrix wird im Hochvakuum des Massenspektrometers mit einem UV-Laser bestrahlt, der explosionsartig die Matrix-Moleküle freisetzt. Es entsteht eine Gaswolke die die positiv geladenen Peptidionen enthält. Die Peptidionen werden dann in einem elektrischen Feld beschleunigt und gelangen in den Time of flight (TOF)-Analysator. Das elektrische Feld beschleunigt alle Ionen mit der gleichen Energie. Die erreichte Geschwindigkeit eines Ions hängt dann von dem Quotienten Masse durch Ladung (m/z) des Ions ab. Daher werden zwei Proteine mit derselben Ladung aber unterschiedlicher Masse unterschiedlich beschleunigt: das Protein mit der kleineren Masse erreicht zudem eine höhere Geschwindigkeit. Ein zweiwertig geladenes Protein erreicht eine höhere Geschwindigkeit als das gleiche Protein mit nur einer Ladung.

Der TOF-Analysator ist ein feldfreies Flugrohr, in dem die Ionen nicht mehr weiter beschleunigt werden, sie fliegen hier mit der zuvor erreichten Geschwindigkeit. Im TOF-Analysator wird die Flugzeit der Ionen vom Eintritt in das Flugrohr bis zum Auftreffen auf einen Detektor am Ende des Flugrohrs gemessen.

Zur Analyse und Identifikation der tryptischen Peptide wurde MALDI-TOF Massenspektrometrie mit einem Massenspektrometer mit einer SCOUT 384 Ionenquelle verwendet. Die Beschleunigungsspannung betrug 25 kV und die Reflektorspannung wurde anfänglich auf 21.6 kV festgesetzt. Die interne Kalibrierung basierte auf tryptischen Peptiden (842,510 Da; 2211.105 Da). Die Reflektionsspannung wurde in 14 Schritten von 21 kV auf 0,65 kV reduziert. Das Zusammenfügen der 14 Einzelspektren basierte auf einer Kalibrierung mit Peptiden aus dem Adrenocorticotrophen Hormon (ACTH). Die Spektren wurden manuell gelabelt. Die Datenaufnahme erfolgte mit einem Sun Ultra Computer unter Zuhilfenahme der XACQ Software, Version 4.0. Die Nachbearbeitung der Daten erfolgte mit Hilfe der XMASS Software.

2.2.9.3 ESI-Massenspektrometrie

Alternativ zur MALDI-TOF-Massenspektrometrie wurde eine ESI-Massenspektrometrie durchgeführt. Hierfür wurde ein Gerät mit einer Elektrospray-Ionenquelle verwendet. Dem Gerät war eine Reversed Phase High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)-Anlage vorgeschaltet.

Bei der ESI werden Proteinionen nicht in eine Matrix eingebaut sondern aus einer feinen Kapillare versprüht.

Gegenüber der Kapillare befindet sich eine Gegenelektrode. Zwischen Kapillare und Gegenelektrode besteht eine sehr hohe Potentialdifferenz so dass je nach Polarität positiv oder negativ geladene Ionen an die Oberfläche der Lösungströpfchen treten. Die Tröpfchen werden somit zum Gegenpol gezogen. Auf dem Weg dorthin verdampft Lösungsmittel und die Tröpfchen werden kleiner. Gleichzeitig nimmt aber die Ladungsdichte zu bis die Tröpfchen schließlich aufgrund der elektrostatischen Abstoßung zerplatzen (Coloumb-Explosion). Es entsteht ein Ionengas.

Dieses Ionengas gelangt in einen Quadrupol-Analysator. Dieser Analysator besteht aus vier parallelen Metallstäben die im gleichen Abstand zueinander angeordnet sind. An die diagonalen Partner werden je ein Wechsel- und ein Gleichstrom angelegt. Der Analysator hat also vier Pole. Zu jedem Ion existiert ein Verhältnis von Gleich- (U) und Wechselspannung (V), das dem Ion die Passage des Analysators ermöglicht. Allerdings können nur Ionen mit einem bestimmten Masse/Ladungsverhältnis können bei einem bestimmten U/V-Verhältnis entlang der vier Pole fliegen, da der Quadrupol als Massenfilter wirkt. Im Zuge des Messvorgangs wird dann V variiert.

Es wurden immer 10 μl einer verdauten Proteinprobe (ca. 75 fmol pro Peptid) in die HPLC-Anlage injiziert. Die Auftrennung der Peptide erfolgte über einen Gradienten von 2-50% Azetonitril (mit 0,1% Ameisensäure) bei einer Flussrate von 0,2 μ/Minute. In der anschließenden Massenspektrometrie wurde eine Spannung von 1000 bis 1200 Volt angelegt um die ESI zu initiieren.

2.2.9.4 Datenbanksuche auf Grundlage der Peptidmassenfingerabdruck-Spektren

Um die in den Gelstücken enthaltenen Proteine schließlich zu identifizieren wurden die mit Hilfe der Massenspektrometrie gemessenen Spektren, die so genannten Peptidmassenfingerabdruckspektren (MALDI-MS) oder Fragmentionenspektren (ESI-MS/(MALDI-MS), mit einer Datenbank verglichen.

Die gemessenen Spektren wurden unter Zuhilfenahme der nichtredundanten NCBI Proteindatenbank mit Hilfe von Biotools (Version 2.2, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland) analysiert. Zur automatischen Interpretation der Fragmentionenspektren (MS/MS) wurde der SEQUEST-Algorithmus (Version 2) während des Screenens der NCBI-Datenbank verwendet.

Die Ergebnisse der Massenspektrometrie wurden in Form von Tabellen aufgelistet, jedes identifizierte Protein wurde der Spotidentifikationsnummer (Spot ID) zugeordnet. Des Weiteren wurde für jedes identifizierte Protein der passende Genname aufgelistet, da dieser im Gegensatz zu den Proteinnamen (es existieren oft verschiedene Namen für das gleiche Protein) eindeutig ist. Alle identifizierten Proteine sowie Zusatzinformationen sind im Anhang (Tabelle 15 und 16) aufgeführt. Im Rahmen der Auswertung der Ergebnisse wurde ausserdem der frei zugängliche Online-Dienst WebGestalt [76] genutzt.