Identifizierte Proteine aus S. meliloti mit erhöhter Expression nach Biotinsupplementation

In ihrer Expression durch Biotin regulierte Proteine sind in Tabelle 7 unter Angabe der theoretisch berechneten Massen und pI-Werte zusammengefaßt. Angegeben wurden die entsprechende Bezeichnung der Proteine oder der ORF-Nummern.

Bei Protein A handelte es sich das um 50S ribosomales Protein L7/L12. Dies deutet darauf hin, daß die Proteinsynthese nach Biotinsupplementation erhöht war.

Die Proteine B und C wurden beide als ORF [SMc02283] identifiziert. Blast-Analysen der Proteinsequenz zeigten, daß dieser ORF Ähnlichkeiten zu CopC aus Agrobacterium tumefaciens C58 (64 % identische Aminosäuren und 81 % ähnliche Aminosäuren) und Aeromonas veronii (37 % identische AS und 51 % ähnliche AS) aufweist. CopC-Proteine sind Kupfer bindende Proteine, die zusammen mit anderen Genprodukten mikrobieller cop-operons an der Resistenz gegenüber Kupfer beteiligt sind und auch Kupfer transportieren (Cooksey, 1994). (Promotoraktivitätsmessungen des copC-Gens siehe unter 3.2.6). Beide Proteine zeigten im SDS-Gel dieselbe Masse und einen schwach voneinander abweichenden pI-Wert, was auf eine natürliche oder durch die Aufbearbeitung artifizielle Modifikation hindeutet, durch die der pI-Wert des Proteins geändert wurde (z.B.

Phosphorylierung). Durch Scan-Prosite-Analyse wurden mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen durch Proteinkinasen gefunden (www.expasy.ch/cgi-bin/scanprosite). Bei Protein D handelte es sich um das RpoZ-Protein (EC 2.7.7.6), der Omega-Untereinheit der RNA-Polymerase. Dies zeigt, daß die Transkription nach Biotinsupplementation verstärkt wird. Die Proteine E, F, H, und I wurden als Komponenten von ABC-Transportern identifiziert. Es handelte sich bei allen vier Proteinen um Bindeproteine für verschiedene Moleküle wie L-Aminosäuren oder Zucker.

Protein G wurde als 2-Keto-3-Desoxy-6-Phosphogluconat-Aldolase, einem Schlüssel-enzym des Entner-Doudoroff Weges, identifiziert. Es katalysiert die Spaltung von 2-Keto-3-Desoxy-6-Phosphogluconat zu Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-Phosphat. Protein J konnte als konserviertes hypothetisches Protein identifiziert werden. Blast-Analysen zeigten, daß das Protein aus S. meliloti 77 % Identität zu einem Protein aus Agrobacterium tumefaciens und 53 % Identität zu einem Protein aus Agrobacterium vitis hat. Bei diesen beiden Organismen ist die Funktion des Proteins bisher ebenso unbekannt wie bei S.

meliloti. Proteine K und L wurden beide als Leucin spezifisches Bindeprotein (Vorläufer) LivK identifiziert. Wie auch bei den Proteinen B und C beobachtet, liefen Proteine K und L auf gleicher Höhe im SDS-Gel und unterschieden sich durch den pI-Wert (siehe Abb. 9),

was auf Modifikationen schließen läßt. Auch in der Proteinsequenz des LivK Proteins konnten durch Scan-Prosite-Analyse potentielle Phosphorylierungsstellen gefunden werden. LivK gehört zu den bakteriellen Aminosäuren bindenden Proteine und ist am spezifischen Transport verzweigter Aminosäuren beteiligt.

Tab. 7 Proteine aus S. meliloti, deren Expression durch Zugabe von 40 nM Biotin signifikant erhöht wurde

A 50S ribosomales Protein L7/L12, [SMc01318/RplL]

Translation 91 4,79/12827

B/C CopC, [SMc02283]

Anmerkung: Im SDS-Gel B und C mit gleichen Massen;

pI-Wert verschieden; Modifikation

E generelles ABC-Transporter-Bindeprotein für L-Aminosäuren, periplasmatisch,

J konserviertes hypothetisches Protein, [SMb20025] unbekannt 54 5,34/34080

K/L Leucin-spezifisches Bindeprotein (Vorläufer), [SMc01946/LivK]

Anmerkung: Im SDS-Gel K und L mit gleichen Massen pI-Wert verschieden; Modifikation

Transport 74/76 5,00/39024

1S. meliloti Kulturen wurden 64-90 h nach Biotinsupplementation geerntet

2unter Standard-Eingabeparameter ermittelter Score-Wert; Score-Werte ab 66 gelten als signifikant (vgl.

Erläuterung im Text)

3anhand der Proteinsequenz theoretisch berechnete pI-und Mr-Werte, die mit der Position der Protein-Spots im Gel verglichen wurden

Desweiteren wurden 3 Proteine massenspektrometrisch analysiert und identifiziert, deren Expression unter den getesteten Versuchsbedingungen nicht signifikant verändert war. Es handelte sich um das Chaperonin A [GroES oder SMc00912], einer Nukleosid-Diphosphat-Kinase [SMc00595], und einem 5´-Nukleotidase-Vorläufer-Protein [SMc01228]. Diese Proteine dienten als interne Markerproteine zur Größen- und pI-Wert-Bestimmung. Zwei dieser Proteine konnten bereits durch andere Arbeitsgruppen identifiziert werden (GroES-Protein und Nukleosid-Diphosphat-Kinase; Guerreiro et al., 1999). Einige Proteine, die eine erhöhte Expression nach Biotinzugabe aufwiesen, wurden durch MALDI-TOF-MS bisher nicht eindeutig als S. meliloti Proteine identifiziert. Bei den in der Tabelle 8 zusammengefaßten Proteinen konnte kein signifikanter Score-Wert erreicht werden. Die ersten drei als nicht signifikant eingestuften Proteine der Liste, bzw.

Proteine aus nahe verwandten Organismen wie Agrobacterium tumefaciens oder M. loti, die das Suchprogramm als Ergebnis lieferte, wurden dennoch daraufhin überprüft, ob es entsprechende Proteine in S. meliloti gab. Traten in der S. meliloti Datenbank keine entsprechenden Proteine dem Namen nach auf, wurde mit Hilfe des blastp-Programmes nach ähnlichen Proteinen gesucht und die Position im Gel überprüft. In der folgenden Tabelle sind jeweils nur die Proteine aufgeführt, die an erster Stelle nach Analyse mit dem Mascot-Suchprogramm in der Liste der besten aber nicht signifikanten Treffer angezeigt wurden.

Tab. 8 Proteine, mit erhöhter Expression nach Biotinzugabe, die nicht eindeutig identifiziert werden konnten

Protein beste Übereinstimmung zu Vergleich mit S. meliloti Datenbank¹

Score-Wert²

M ABC-Transporter-Bindeprotein [M. loti] 44 % Identität/ 61 % Ähnlichkeit zu LEU/ILE/VAL-bindendes Protein aus S. meliloti [SMc00078 oder LivJ]

46

N Guanylat Kinase

[Streptococcus pyogenes M1 GAS]

43 % Identität/ 62 % Ähnlichkeit zur Guanylat-Kinase aus S. meliloti,

50

O Chromosomen-Trennungs-Protein

[Lactococcus lactis subsp. lactis]

34 % Identität/ 58 % Ähnlichkeit zu [SMc02801 oder ParB]

53

P Malat-Dehydrogenase [E. coli] 30 % Identität/ 49 % Ähnlichkeit zur

Malat-Dehydrogenase aus S. meliloti 48

Q MucB-Protein [Salmonella typhimurium] kein homologes Protein in S. meliloti vorhanden

53

R Protein zur Initiation der Plasmidreplikation [Bacillus subtilis]

kein homologes Protein in S. meliloti vorhanden

46

S hypothetisches Protein [Staphylococcus

aureus subsp. aureus]

kein homologes Protein in S. meliloti vorhanden

56

1nicht angegeben wurden die theoretisch berechneten pI-Werte und Molekularen Massen, da bei den hier aufgeführten S. meliloti Proteinen keiner der beiden Parameter oder nur einer mit der Position des Proteins im Gel übereinstimmten

2unter Standard-Eingabeparameter ermittelter Score-Wert; Score-Werte ab 66 gelten als signifikant