I DENTIFIZIERUNG AM A BBAU VON P FLANZENMATERIAL BETEILIGTER B AKTERIEN

3. ERGEBNISSE

3.6. I DENTIFIZIERUNG AM A BBAU VON P FLANZENMATERIAL BETEILIGTER B AKTERIEN

3.6. Identifizierung am Abbau von Pflanzenmaterial beteiligter Bakterien

A

0 5 10 15 20 25 30 35

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

μmol CO2/g soil

time [h]

0 10 20 30 40 50

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

atom% 13CO2

time [h]

B

Zeit [h]

μmol CO2/g BodenCO2 [μmol g Boden -1]Atom% 13CO213CO2 [atom%]

Abbildung 23. Bildung von Gesamt-CO2 (A) und ¹³CO2 (B) in der Gasphase der Mikrokosmen über eine Inkubationsdauer von 7 Tagen. Es wurden Mittelwerte (n=3) ± SD aufgetragen. Grünlandboden ohne Zusatz (^__), inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln () oder -blättern () und ¹²C-Weizenwurzeln () oder -blättern ();

Waldboden ohne Zusatz (--), inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln () oder -blättern () und ¹²C-Weizenwurzeln () oder -blättern ().

Nur der mit ¹³C-Weizenblättern inkubierte Grünlandboden zeigte kontinuierlich steigende

13CO2-Werte (24 h: 20%, 48 h: 24%, 72 h: 30%, 96 h: 35%, 168 h: 43%, Abb. 20B) und erreichte damit nach 7 Tagen fast das Maximum der Inkubation von Waldboden mit Weizenwurzeln (48 % ¹³CO2 nach 48 h, Abb. 23B). Die Kontrollmikrokosmen mit Grünland- oder Waldboden ohne Pflanzenmaterial bzw. mit unmarkierten Weizenblättern

oder -wurzeln zeigten keine ¹³CO2-Produktion (atmosphärischer Gehalt von ~1.01%

13CO₂, Abb. 23B).

Nach 24, 48, 72, 96 und 168 h der Inkubation, wurde die Gesamt-RNA von Grünland- und Waldboden inkubiert mit ¹³C- oder unmarkierten Weizenblättern oder -wurzeln extrahiert.

Die mit ¹³C angereicherte ‚schwere’ RNA wurde von unmarkierter ‚leichter’ RNA

Grünland Wald

RelativeFluoreszenzRelativeFluoreszenzRelativeFluoreszenz

RelativeFluoreszenzRelative Fluoreszenz

T-RF-Länge (bp) T-RF-Länge (bp)

Abbildung 24. Terminale Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-(T-RFLP)-Analysen der nach Dichte aufgetrennten bakteriellen 16S rRNA von ausgewählten ‚leichten’ und ‚schweren’ Cäsiumtrifluoracetat-(CsTFA)-Gradientenfraktionen der mit ¹³C-markierten Weizenwurzeln für 24, 48, 72, 96 und 168 Stunden inkubierten Grünland- und Waldbodenmikrokosmen. Die Länge der wichtigsten T-RFs (bp) und die Dichte (g ml^-1) der einzelnen Fraktionen ist angegeben.

durch Dichtegradientenzentrifugation getrennt. Typischerweise hat vollständig ¹³ C-markierte rRNA eine Dichte (BD) von 1,81-1,82 g ml^-1 in Cäsiumtrifluoracetat (CsTFA) (Lueders et al., 2004a). Die bakterielle 16S rRNA der Gradientenfraktionen wurde über T-RFLP-‚fingerprinting’ analysiert um die Mitglieder der mikrobiellen Gemeinschaft zu identifizieren, die die ¹³C-Markierung am effektivsten in ihre RNA eingebaut haben und somit aktiv am Abbau von Weizenmaterial beteiligt waren. Die Profile der bakteriellen 16S rRNA aller Gradientenfraktionen zeigten, dass unterschiedliche Populationen an der Assimilierung von ¹³C aus Weizen beteiligt waren, abhängig vom Zeitpunkt der Inkubation, der Art des Weizenmaterials und dem Boden (Abb. 24, 25, Anhang Abb. 10). Schon nach 24 h konnte eine Veränderung in den Profilen der bakteriellen Gemeinschaft von ‚leichten’

(BD <1.80 g ml^-1) zu ‚schweren’ (BD >1.81 g ml^-1) Gradientenfraktionen für Grünland- und Waldbodeninkubationen mit ¹³C-Wurzeln oder -Blättern festgestellt werden

1312 Abbildung 25. Terminale Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus-(T-RFLP)-Analysen der nach Dichte aufgetrennten bakteriellen 16S rRNA von ausgewählten ‚leichten’ und ‚schweren’ Cäsiumtrifluoracetat-(CsTFA)-Gradientenfraktionen der mit 13 C-markierten Weizenwurzeln, 12 C-markierten Weizenwurzeln oder ohne zusätzlic Pflanzenmaterial für 72 Stunden inkubierten Grünland-(A) und Waldbodenmikrokosmen (B).Die Länge der wichtigsten T-RFs (bp) und die Dichte (g ml-1 ) der einz Fraktionen ist angegeben.

Klonbibliothek 13C-HEG Klonbibliothek 13C-HEW

Pyrosequenzierung13CGH Pyrosequenzierung13CGL Pyrosequenzierung12CGL

Pyrosequenzierung12CGH PyrosequenzierungBGL Pyrosequenzierung13CFH Pyrosequenzierung13CFL

Pyrosequenzierung12CFH Pyrosequenzierung12CFL PyrosequenzierungBFL

Relativ eFlu

oreszenz eszenz e Fluor Relativ

T-RF-Länge (bp) T-RF-Länge (bp) T-RF-Länge (bp)

PPC-Weizenwurzeln PPC-Weizenwurzeln Boden/Kontrolle

(Abb. 24, Anhang Abb. 10). In den Weizenwurzel-Inkubationen des Grünland- als auch des Waldbodens waren die T-RFs 89, 148 und/oder 157 bp nach 24 h in den ‚schweren’

Fraktionen abundanter als in den ‚leichten’ Fraktionen. Nach 48 h war das T-RF 148 bp allerdings nur noch in den ‚leichten’ Fraktionen abundant zu finden. Nach drei Tagen Inkubation des Grünlandbodens mit ¹³C-Weizenwurzeln zeigten sich die T-RFs 435 und 490 bp in den ‚schweren’ Fraktionen, die T-RFs 148 und 157 bp waren hingegen in allen Fraktionen abundant. Die Abundanz des T-RF 490 bp nahm in den ‚schweren’ Fraktionen der Grünlandboden-Inkubationen nach 96 h sogar noch zu. Im Waldboden waren nach 72 h die T-RFs 89, 157 und 490 bp in ‚schweren’ Fraktionen abundanter verglichen mit

‚leichten’ Fraktionen. Nach vier Tagen Inkubation schien die Weizenwurzeln abbauende bakterielle Gemeinschaft diverser zu werden mit z.B. einem zusätzlichen Peak bei 554 bp.

Am Ende der 7-tägigen Inkubation mit Weizenwurzeln dominierte in den ‚schweren’

Fraktionen sowohl im Grünland- als auch im Waldboden nur noch das T-RF 148 bp (Abb.

24).

Acidobacteria (2 %)

Actinobacteria(50%)

Bacteroidetes(1%) Firmicutes (11%)

Planctomycetes (2%)

-Proteobacteria (15%)

-Proteobacteria (18%) -Proteobacteria (2%)

Verrucomicrobia (1%) Wald

n = 128

Acidobacteria (2 %)

Actinobacteria(50%)

Bacteroidetes(1%) Firmicutes (11%)

Planctomycetes (2%)

-Proteobacteria (15%)

-Proteobacteria (18%) -Proteobacteria (2%)

Verrucomicrobia (1%) Wald

n = 128

Acidobacteria (2 %)

Actinobacteria(50%)

Bacteroidetes(1%) Firmicutes (11%)

Planctomycetes (2%)

-Proteobacteria (15%)

-Proteobacteria (18%) -Proteobacteria (2%)

Verrucomicrobia (1%) Acidobacteria (2 %)

Actinobacteria(50%)

Bacteroidetes(1%) Firmicutes (11%)

Planctomycetes (2%)

-Proteobacteria (15%)

-Proteobacteria (18%) -Proteobacteria (2%)

Verrucomicrobia (1%) Wald

n = 128 Acidobacteria(6%)

Actinobacteria(26%)

Bacteroidetes(6%) Chloroflexi (1%) Firmicutes (4%) Gemmatimonadetes (1%) Planctomycetes (4%)

- Proteo-bacteria (14%) -Proteobacteria (20%)

-Proteo-bacteria (18%) -Proteobacteria (2%)

Verrucomicrobia (1%) Grünland

n = 137

Acidobacteria(6%)

Actinobacteria(26%)

Bacteroidetes(6%) Chloroflexi (1%) Firmicutes (4%) Gemmatimonadetes (1%) Planctomycetes (4%)

- Proteo-bacteria (14%) -Proteobacteria (20%)

-Proteo-bacteria (18%) -Proteobacteria (2%)

Verrucomicrobia (1%) Grünland

n = 137

Acidobacteria(6%)

Actinobacteria(26%)

Bacteroidetes(6%) Chloroflexi (1%) Firmicutes (4%) Gemmatimonadetes (1%) Planctomycetes (4%)

- Proteo-bacteria (14%) -Proteobacteria (20%)

-Proteo-bacteria (18%) -Proteobacteria (2%)

Verrucomicrobia (1%)

Acidobacteria(6%)

Actinobacteria(26%)

Bacteroidetes(6%) Chloroflexi (1%) Firmicutes (4%) Gemmatimonadetes (1%) Planctomycetes (4%)

- Proteo-bacteria (14%) -Proteobacteria (20%)

-Proteo-bacteria (18%) -Proteobacteria (2%)

Verrucomicrobia (1%) Grünland

n = 137

Abbildung 26. Zuordnung der 16S rRNA-Klonsequenzen der ‚schweren’ CsTFA-Gradientenfraktionen (1,82 g ml^-1) der Grünland- und Waldbodenmikrokosmen inkubiert für 72 h mit ¹³C-Weizenwurzeln zu verschiedenen Bacteria-Phyla.

Die T-RFLP-Profile für beide Weizenmaterialien, Wurzeln und Blätter, schienen in Grünland- und Waldboden auf den ersten Blick sehr ähnlich zueinander. In den Inkubationen mit Weizenblättern zählte das T-RF 89 bp allerdings schon nach 48 h nicht mehr zu den dominierenden im Waldboden. Außerdem tauchte das T-RF 435 bp in den Grünlandböden und das T-RF 490 bp in den Waldböden kaum auf. Dagegen war in den Weizenblatt-Inkubationen nach 96 h das 554-bp-T-RF in den ‚schweren’ Fraktionen beider Böden vertreten und im Waldboden zusätzlich ein T-RF von 438 bp (Anhang Abb. 10).

Tabelle 21. Zuordnung der 16S rRNA-Sequenzen der ‚schweren’ CsTFA-Gradientenfraktionen (1,82 g ml^-1) der Grünland- und Waldbodenmikrokosmen inkubiert für 72 h mit ¹³C-Weizenwurzeln zu verschiedenen Bacteria-Phyla. Charakteristische in silico T-RFs (bp) der verschiedenen pyhlogenetischen Gruppen, die mehr als eine Sequenz repräsentieren, sind hervorgehoben und entsprechende in vivo T-RFs angegeben.

Phylogenetische Gruppe Grünland Klone (n)

Wald

Klone (n) in silico T-RFs (bp) in vitro T-RFs (bp)¹

Acidobacteria 8 2

Gp1 2 265

Gp4 1 95

Gp6 7 200, 216, 228, 292/294 290

Actinobacteria 36 64

Acidimicrobidae 3 170, 527

Actinobacteridae 26 64 67, 141, 147, 159/161/163 140-144, 155-162,

Streptomycetaceae 2 44 157, 159, 163, 169 155-162

Rubrobacteridae 7 132, 140/142, 527 131-135, 137-145

Bacteroidetes 8 1

Flavobacteria 5 83/85/87 81-90

Sphingobacteria 3 1 79, 93, 207, 485

Chloroflexi 1 174

Firmicutes 5 14

Bacillaceae 1 8 145/147, 151/153 144-148, 155/156

Paenibacillaceae 2 6 153, 159/161 155/156, 157/159

Staphylococcaceae 2 82

Gemmatimonadetes 1 77

Planctomycetes 5 2 66/68, 122, 127, 132, 166, 743

Proteobacteria 71 44

-Proteobacteria 19 19

Caulobacterales 1 437

Geminicoccus 2 150/152

Rhizobiales 14 14 79, 108, 128, 150/152, 401, 437 127/128, 148/154, 434/438 Rhodobacterales 3 1 119, 152, 439, 455

Rhodospirillales 3 67, 445

-Proteobacteria 27 23

Alcanigenaceae 1 141

Burkholderiaceae 11 2 141, 414, 436, 481 138-144, 434/438 Burkholderiales ² 2 1 134, 141

Comamonadaceae 3 6 141, 490 487/490

Oxalobacteriaceae 10 14 483, 488/490 487/490

-Proteobacteria 3 2

Moraxellaceae 3 299

Pseudomonadaceae 1 490

Xanthomonadaceae 1 452

-Proteobacteria 22

Cystobacteraceae 12 127, 158/160 157/158/160

Desulfuromonadales 2 506

Nannocystinae 3 128, 132, 216

Soranginae 5 78, 219, 504

Verrucomicrobia 2 1 126, 169, 479

1 ± 3 bp ausgehend von in silico T-RFs 2 incertae sedis

Nach einer Inkubation von 72 h wurde die Weizenwurzeln abbauende mikrobielle Gemeinschaft genauer charakterisiert, indem unter anderem die T-RFLP-Profile der ¹³C- mit denen der Kontrollinkubationen (¹²C und Boden) verglichen wurde (Abb. 25). In ¹²C- und Bodeninkubationen konnte nur für weniger ‚schwere’ oder sogar nur die ‚leichten’

Fraktionen nach 72 h ein PCR-Produkt erhalten werden. Die daraus resultierenden T-RFLP-Profile waren vergleichbar mit der ‚leichten’ Fraktionen der ¹³C-Inkubation,

Abbildung 27. Neighbour-Joining-Baum der 16S rRNA-Sequenzen der Actinobacteria der ‘schweren’ Fraktion (BD 1,82 g ml^-1) der Grünland- (13C-HEG) und Waldboden-Inkubationen (13C-HEW) nach 72 Stunden. T-RF-Längen (bp) wurden mittels in silico-Verdau der 16S rRNA-Sequenzen mit dem Restriktionsenzym MspI bestimmt. Der Maßstab stellt 10% Sequenzunterschied dar, GenBank ‚accession numbers’ der Referenzsequenzen sind angegeben.

wohingegen sich die aktiv Weizenwurzeln abbauende Bakteriengemeinschaft, repräsentiert durch die T-RFs bei 89, 148, 157, 435 und 490 bp in den ‚schweren’

Fraktionen der ¹³C-Inkubation nach 72 h, deutlich davon unterschiedet (Abb. 25).

Nach 72 h wurde die 16S rRNA der ‚schweren’ Fraktionen (BD 1,82 g ml^-1) der ¹³ C-Weizenwurzel-Inkubationen von Grünland- und Waldboden revers transkribiert, die cDNA amplifiziert, über Klonierung vereinzelt und sequenziert, um an der Assimilierung von Kohlenstoff aus Weizen aktiv beteiligte Bakterien zu identifizieren und diese den beobachteten T-RFs zuordnen zu können. Die Sequenzierung und Analyse von 137 und 128 Klonen der ‚schweren’ Fraktion von Grünland- und Waldboden erlaubte die phylogenetische Zuordnung der bakteriellen Sequenzen mit einer Abdeckung der Diversität (Coverage, 3% Sequenzunterschied als Abgrenzung zwischen Arten (Stackebrandt und Goebel, 1994)) von 50 und 77%. Die vergleichende Sequenzanalyse zeigte entsprechend eine diversere Weizen abbauende Bakteriengemeinschaft im Grünland- (Anzahl der OTUs: 87, Shannon-Index: H=4,2) als im Waldboden (Anzahl der OTUs: 51, Shannon-Index: H=3,5). Die ‚schwere’ Fraktion im Grünlandboden wurde von Actinobacteria, -, - und -Proteobacteria, Acidobacteria und Bacteroidetes dominiert, wohingegen im Waldboden Actinobacteria, - und -Proteobacteria und Firmicutes vorherrschten (Abb. 26, 27, Tab. 21, Anhang Abb. 11-15). Laut RDP-Klassifizierung (‚Ribosomal Database Project’, (Cole et al., 2009)) der Sequenzen stellen im Grünlandboden Ralstonia Proteobacteria), Cystobacter Proteobacteria), Massilia (-Proteobacteria), Pseudonocardia (Actinobacteria, Abb. 24), Flavobacterium (Bacteroidetes) und Afipia (-Proteobacteria) die abundantesten Gattungen ( 5 Klone).

Im Waldboden dagegen dominierten Streptomyces (Actinobacteria, Abb. 27), Streptacidiphilus (Actinobacteria, Abb. 24), Bacillus (Firmicutes), Kitasatospora (Actinobacteria, Abb. 27), Humicoccos (Actinobacteria, Abb. 27), Paenibacillus (Firmicutes), Massilia (-Proteobacteria) und Bradyrhizobium (-Proteobacteria). Die in silico T-RFLP-Analyse der erhaltenen Klonsequenzen erlaubte es die beobachteten in vivo T-RFs verschiedenen phylogenetischen Gruppen zuzuordnen. So konnte das T-RF 148 bp Rhizobiales und Bacillaceae, T-RF 157 bp Actinobacteridae, Paenibacillaceae und Cystobacteraeae, T-RF 435 bp Burkholderiaceae und T-RF 490 bp Comamonadaceae und Oxalobacteraceae zugeordnet werden (Tab. 21).

Zusätzlich wurde die bakterielle 16S rRNA in den ‚schweren’ (~ BD 1,815 g ml^-1) und

‚leichten’ (~ BD 1.795 g ml^-1) Fraktionen der ¹³C- und ¹²C-Inkubationen mit Weizenwurzeln sowie von Grünland- und Waldboden ohne Zusatz von Weizenwurzeln nach 72 h mittels 454-Pyrosequenzierung analysiert. Die verwendeten Fraktionen sind in Abbildung 25 gekennzeichnet. Alle zehn Proben enthielten einen individuellen Barcode,

Tabelle 22. Zusammenfassung der 454-Pyrosequenzierung der ‚schweren’ (H, BD > 1,81 g ml-1 ) und ‚leichten’ (L, BD < 1,81 g ml-1 ) CsTFA-Gradientenfraktionen von Grünlandboden (BGL) inkubiert mit 13 C Weizenwurzeln (13CGH und 13CGL) oder 12 C-Weizenwurzeln (12CGH und 12CGL) und von Waldboden (BFL) inkubiert mit Weizenwurzeln (13CFH und 13CFL) oder 12 C-Weizenwurzeln (12CFH und 12CFL). Anzahl der Cluster, Chao1, Shannon-Diversität und Evenness wurden mit Hilfe der RDP- Pyrosequencing-Pipeline für 3%, 5% und 10% Sequenzunterschied berechnet. Probe Reads gefilterte Reads

mittlere Sequenz- länge BacteriaAnzahl der Cluster Chao1 Shannon-Diversität Evenness 3 %5 %10 %3 %5 %10 %3 %5 %10 %3 %5 %10 % 13CGH 57020 34265 289 bp32645 8121 5113 2333 11633 5793 2380 7,76 7,26 6,43 0,86 0,85 0,83 13CGL 31636 18058 403 bp18053 4349 2976 1337 7079 4201 1576 7,56 7,07 6,14 0,90 0,88 0,85 12CGH 102440 60180 401 bp60166 9706 6193 2487 14460 8171 2854 8,07 7,48 6,54 0,88 0,86 0,84 12CGL 44270 25787 404 bp25785 5400 3590 1573 8490 4979 1832 7,67 7,16 6,26 0,89 0,87 0,85 BGL 36297 20587 401 bp20582 4916 3300 1477 8032 4718 1727 7,69 7,16 6,27 0,90 0,88 0,86 13CFH 38853 24377 383 bp24354 2054 1265 519 2889 1727 628 6,00 5,32 4,39 0,79 0,74 0,70 13CFL 31387 17669 409 bp17655 3617 2364 1001 5797 3256 1140 7,12 6,60 5,66 0,87 0,85 0,82 12CFH 31414 18598 408 bp18593 3497 2276 935 5513 3051 1069 7,04 6,48 5,54 0,86 0,84 0,81 12CFL 42886 24155 411 bp24145 4574 2986 1208 6951 4090 1397 7,33 6,76 5,75 0,87 0,85 0,81 BFL 34507 17851 411 bp17844 3883 2605 1095 6103 3622 1254 7,27 6,68 5,81 0,88 0,85 0,83 Total 450710 261527 392 bp 259822

wurden zu gleichen Anteilen gemischt, analysiert und die Ergebnisse entsprechend der Barcodes nach Proben getrennt. Insgesamt wurden 450.710 Sequenzen erhalten, etwa 42% davon entsprachen jedoch nicht den festgelegten Qualitätskriterien und wurden für weitere Analysen entfernt. Dieser relativ große Anteil an Sequenzen geringer Qualität kann durch viele kurze Sequenzen erklärt werden, die Primer-Dimere mit einer Größe von

> 70 bp darstellen, die durch die Aufreinigung der PCR-Produkte mit dem MinElute-Kit (Qiagen, Hilden) vor der Pyrosequenzierung nicht erfolgreich entfernt werden konnten.

Zur weiteren Analyse konnten dennoch 259.822 partielle bakterielle 16S rRNA-Sequenzen mit einer mittleren Sequenzlänge von 392 bp verwendet werden. Die Anzahl

andere Bacteria unklass. Bacteria Chloroflexi Planctomycetes Verrucomicrobia Acidobacteria Gemmatimonadetes Gammaproteobacteria Alphaproteobacteria Betaproteobacteria Deltaproteobacteria unclass. Proteobacteria Bacteroidetes Firmicutes Actinobacteria

Abbildung 28. Phylogenetische Zuordnung der 16S rRNA-Sequenzen der 454-Pyrosequenzierung (RDP Classifier) der ‚schweren’ (H, BD > 1,81 g ml^-1) und ‚leichten’ (L, BD < 1,81 g ml^-1) CsTFA-Gradientenfraktionen von Grünlandboden (BGL) inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln (13CGH und 13CGL) oder

12C-Weizenwurzeln (12CGH und 12CGL) und von Waldboden (BFL) inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln (13CFH und 13CFL) oder ¹²C-Weizenwurzeln (12CFH und 12CFL). Zum direkten Vergleich von Pyrosequenzierung und Klonbibliotheken ist auch die Zugehörigkeit der 16S rRNA-Klonsequenzen der ‚schweren’ CsTFA-Gradientenfraktionen (1,82 g ml^-1) der Grünland- (13C-HEG) und Waldbodenmikrokosmen (13C-HEW) inkubiert für 72 h mit ¹³C-Weizenwurzeln zu verschiedenen Bacteria-Phyla angegeben.

32 29 31 29 29

50 52

25 27

20 20

4 2

11 5

16 4

11 13

4 4

5 6

9 4 4 4 4

18 17

4 3

3 2

17 16 16

16 15

30 35

34 32

12 11 11

11 12

12 12

3 3 3

6 4

5 8

100%

13C-HEG

13CGH 13CGL 12CGH 12CGL BGL 13C-HEW

13CFH 13CFL 12CFH 12CFL BFL 80%

60%

40%

20%

Grünland Wald

der Sequenzen pro Probe variierte zwischen 17.669 und 60.180 (Tab. 22). Die Diskrepanz zwischen der Anzahl der Cluster und der Schätzung des Artenreichtums mittels Chao1 zeigt, dass selbst mit dieser hohen Zahl an Sequenzen noch nicht alle Phylotypen der Proben detektiert wurden. Die Shannon-Diversität der bakteriellen Gemeinschaften war in

Tabelle 23. Phylogenetische Zuordnung (RDP Classifier) der 16S rRNA-Sequenzen der 454-Pyro-sequenzierung der ‚schweren’ (H, BD > 1,81 g ml^-1) und ‚leichten’ (L, BD < 1,81 g ml^-1) CsTFA-Gradienten-fraktionen von Grünlandboden (BGL) inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln (13CGH und 13CGL) oder ¹² C-Weizen-wurzeln (12CGH und 12CGL) und von Waldboden (BFL) inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln (13CFH und 13CFL) oder ¹²C-Weizenwurzeln (12CFH und 12CFL). Der prozentuale Anteil jeder taxonomischen Gruppe ist dargestellt. Am Abbau von Weizenwurzeln beteiligte Phyla oder -klassen sind fett hervorgehoben.

Grünland Wald

Phylum Klasse 13CGH 13CGL 12CGH 12CGL BGL 13CFH 13CFL 12CFH 12CFL BFL

unklass. Bacteria 16,47 13,57 12,22 12,84 13,41 1,33 8,63 8,17 9,91 10,01

OD1 - 0,01 0,00 - - - - - - -

BRC1 - 0,01 0,01 0,00 0,02 - 0,01 0,01 - -

Actinobacteria 31,80 28,60 31,43 28,63 28,84 52,04 24,79 26,89 19,97 20,34 Acidimicrobidae 0,36 1,35 1,68 1,85 1,44 0,06 0,52 0,72 0,53 0,45 Rubrobacteridae 0,8 5,31 3,92 4,54 4,46 0,22 1,63 1,33 1,67 1,50 Actinobacteridae 29,05 20,76 24,62 21,17 21,69 51,63 21,88 24,07 17,00 17,41 Firmicutes 2,20 1,20 1,07 1,17 1,25 5,26 0,66 0,27 0,29 0,30

Bacilli 1,98 0,89 0,73 0,75 0,90 5,23 0,61 0,23 0,26 0,27

Clostridia 0,10 0,25 0,28 0,37 0,27 0,00 0,05 0,04 0,03 0,02 TM7 0,03 0,01 0,01 0,02 0,01 0,24 0,03 0,01 0,01 0,01

Spirochaetes - - 0,02 - 0,00 - - - - -

Bacteroidetes 2,91 2,13 2,02 2,14 2,03 1,21 1,55 1,20 2,00 1,59 Sphingobacteria 1,30 1,43 1,20 1,24 1,34 1,09 1,21 0,83 1,51 1,13 Flavobacteria 1,28 0,19 0,24 0,25 0,14 0,02 0,15 0,11 0,20 0,13 Proteobacteria 44,21 36,17 35,68 37,53 35,79 35,67 42,25 45,59 46,52 44,14 -Proteobacteria 3,90 11,84 11,25 12,67 11,63 0,28 4,12 3,56 4,81 5,67 -Proteobacteria 8,50 3,89 4,04 4,25 3,70 17,32 3,95 3,11 3,18 2,16 -Proteobacteria 26,53 16,50 16,41 16,21 15,85 14,88 29,87 34,99 34,45 32,15 -Proteobacteria 1,66 1,53 1,41 1,69 1,86 2,38 2,06 1,44 1,89 1,75 Nitrospira 0,01 0,46 0,41 0,42 0,43 0,01 0,10 0,18 0,11 0,16 Gemmatimonadetes 0,04 0,18 0,22 0,28 0,25 0,07 0,45 0,45 0,42 0,42 Acidobacteria 1,44 11,70 11,02 11,40 11,37 3,38 10,91 12,27 11,94 12,08 Gp1 0,00 0,01 0,02 0,03 0,01 2,51 4,42 4,96 4,41 4,73 Gp2 - 0,01 - 0,00 - 0,14 1,27 1,02 1,12 0,95 Gp3 0,08 0,13 0,59 0,24 0,20 0,27 0,50 1,74 0,70 0,94 Gp4 0,05 0,69 0,49 0,55 0,64 0,02 0,47 0,54 0,70 0,59 Gp5 0,09 0,53 0,49 0,46 0,45 0,02 0,45 0,43 0,56 0,54 Gp6 1,00 7,29 6,72 7,12 7,02 0,27 2,77 2,34 2,91 2,88 Gp7 0,01 0,14 0,13 0,18 0,17 0,01 0,11 0,10 0,17 0,16 Gp11 0,02 0,25 0,36 0,28 0,22 0,01 0,06 0,10 0,10 0,08 Gp16 0,08 1,94 1,60 1,73 1,94 0,06 0,57 0,71 0,97 0,80 Gp17 0,04 0,49 0,40 0,55 0,50 - 0,08 0,11 0,12 0,16 Gp22 - 0,12 0,09 0,17 0,08 0,00 0,09 0,06 0,10 0,15 Verrucomicrobia 0,22 1,57 1,93 1,37 1,54 0,06 4,53 1,15 3,55 3,00 Spartobacteria 0,05 0,32 0,54 0,27 0,36 0,04 2,31 0,56 1,50 1,44 Opitutae 0,05 0,32 0,37 0,51 0,29 0,01 0,11 0,09 0,21 0,18 Subdivision3 0,05 0,75 0,82 0,50 0,72 0,01 1,72 0,37 1,58 1,13 WS3 - 0,02 0,01 0,04 0,00 - 0,05 0,03 0,04 0,06 Planctomycetes 0,47 3,40 3,07 3,33 4,22 0,70 5,85 3,50 4,90 7,54

Cyanobacteria 0,01 0,06 0,05 0,05 0,05 0,00 - - - 0,01

OP10 - 0,01 0,02 0,01 0,02 - 0,01 0,02 0,02 0,01

Chloroflexi 0,18 0,89 0,79 0,76 0,76 0,00 0,05 0,11 0,17 0,15

Bacteria inc. sed. - 0,01 - - - 0,01 0,16 0,15 0,15 0,18

Inkubationen mit Grünlandboden generell höher als in denen mit Waldboden und korreliert per Definition positiv mit der Anzahl der Phylotypen und der Evenness der Gemeinschaft (Tab. 22).

Die relative Abundanz einiger Bacteria-Phyla und Gattungen unterschied sich zwischen den ‚schweren’ ¹³C-Fraktionen (13CGH und 13CFH) und den entsprechenden Kontrollen (13CGL, 12CGH, 12CGL, BGL und 13CFL, 12CFH, 12CFL, BFL, Abb. 28, 29, 30, Tab.

23, 24) und erlaubte so die Identifizierung der aktiv an der Kohlenstoff-Assimilierung ausgehend von Weizenwurzeln beteiligten und unbeteiligten Bodenbakterien. Im Grünlandboden steigerte die Zugabe von Weizenwurzeln die Aktivität von Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes und Firmicutes in der ‚schweren’ ¹³C- Fraktion verglichen

Abbildung 29. Acidobacteria-Untergruppen der 16S rRNA-Sequenzen der 454-Pyrosequenzierung (RDP Classifier) der ‚schweren’ (H, BD > 1,81 g ml^-1) und ‚leichten’ (L, BD < 1,81 g ml^-1) CsTFA-Gradientenfraktionen von Grünlandboden (BGL) inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln (13CGH und 13CGL) oder

12C-Weizenwurzeln (12CGH und 12CGL) und von Waldboden (BFL) inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln (13CFH und 13CFL) oder ¹²C-Weizenwurzeln (12CFH und 12CFL).

4 5

4 1

1 1

1 2

1 1 1

7 7 7 7

3 2

2 2 2

1 1

0 2 4 6 8 10 12

13CGH 13CGL 12CGH 12CGL BGL 13CFH 13CFL 12CFH 12CFL

5 1 1 1 1 3 1

BFL andere

Grünland Wald

Acidobacteria

Gp17 Gp16 Gp11 Gp6 Gp5 Gp4 Gp3 Gp2 Gp1

211111111 3222 1111

114 544 4

11 66

1 5

1 11 114 2

2 11

814 9 10

11 1010

5 4

4 33 0

50 13CGH13CGL12CGH12CGLBGL13CFH13CFL12CFH12CFLBFL

Actinobacteria Grünland Wald

42333 12222

4444 1112

6222 2

2 6866

6 555 53 99109

4 222 23

667 6

11 10 1110 109

87 7 010203040

70 13CGH13CGL12CGH12CGLBGL13CFH13CFL12CFH12CFLBFL

Proteobacteriaandere Actinobacteria unklass. Micromonosporaceae GrünlandWald

Mycobacterium unklass. Propionibacteriaceae Marmoricola Nocardioides Streptomyces Kitasatospora Streptacidiphilus Humicoccus Arthrobacter unklass. Micrococcineae unklass. Pseudonocardiaceae Catenulispora unklass. Actinomycetales Solirubrobacter unklass. Solirubrobacterales unklass. Actinobacteria unklass. Proteobacteriaunklass. Deltaproteobacteria unklass. MyxococcalesCystobacter unklass. Sorangiineaeunklass. Polyangiaceae unklass. Nannocystineaeunklass. Burkholderiales inc. sed. Burkholderiaunklass. Oxalobacteraceae DuganellaMassilia JanthinobacteriumHerbaspirillum Collimonasunklass. Comamonadaceae Variovoraxunklass. Alphaproteobacteria unklass. Rhizobialesunklass. Bradyrhizobiaceae Bradyrhizobiumunklass. Phyllobacteriaceae unklass. RhodospirillalesDefluviicoccus unklass. AcetobacteraceaeAmaricoccus unklass. Xanthomonadaceaeandere

Abbildung 30. Actinobacteria und Proteobacteria der 16S rRNA-Sequenzen der 454-Pyrosequenzierung (RDP Classifier) der ‚schweren’ (H, BD > 1,81 g ml^-1) und ‚leichten’ (L, BD < 1,81 g ml^-1) CsTFA-Gradientenfraktionen von Grünlandboden (BGL) inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln (13CGH und 13CGL) oder

12C-Weizenwurzeln (12CGH und 12CGL) und von Waldboden (BFL) inkubiert mit ¹³C-Weizenwurzeln (13CFH und 13CFL) oder ¹²C-Weizenwurzeln (12CFH und 12CFL).

mit der ‚leichten’ ¹³C-Fraktion, den ¹²C und Bodenkontrollen. Vertreter der -Proteobacteria (Amaricoccus, Mesorhizobium, Balneimonas), -Proteobacteria (Massilia, Duganella, Variovorax, Pelomonas), einige -Proteobacteria (Cystobacter), Actinobacteridae (Arthrobacter, Agromyces, Kitasatospora), Flavobacterium und Paenibacillus waren am aktivsten am Umsatz der Weizenwurzeln beteiligt (Abb. 28, 30, Tab. 23, 24). Dagegen sank vor allem die Aktivität der Acidobacteria (Abb. 29) aber auch einiger -Proteobacteria (z.B. Geobacter), Rubrobacteridae, Planctomycetes, Verrucomicrobia, Acidimicrobidae, Chloroflexi, Nitrospira und Gemmatimonadetes (Tab.

23) - diese waren offenbar nicht am Abbau von Weizenwurzeln im Grünlandboden beteiligt. Im Waldboden steigerte die Zugabe von Weizenwurzeln die Aktivität der Actinobacteria, Proteobacteria und Firmicutes in der ‚schweren’ ¹³C-Fraktion verglichen mit der ‚leichten’ ¹³C-Fraktion, den ¹²C- und Bodenkontrollen. Hier schienen vor allem Actinobacteridae (Streptomyces, Streptacidophilus, Kitasatospora, Arthrobacter, Catenulispora, Humicoccus), -Proteobacteria (Duganella, Burkholderia, Variovorax, Janthinobacterium, Collimonas, Herbaspirillum, Ralstonia, Pelomonas, Massilia), einige -Proteobacteria (Rhizobium, Mesorhizobium, Labrys) und Bacilli (Bacillus, Paenibacillus) aktiv an der Umsetzung der Weizenwurzeln beteiligt zu sein (Abb. 28, 30, Tab. 23, 24).

Dagegen sank auch im Waldboden vor allem die Aktivität der Acidobacteria (Abb. 29) aber auch einiger -Proteobacteria, -Proteobacteria, Rubrobacteridae, Planctomycetes, Verrucomicrobia, Acidimicrobidae und Gemmatimonadetes (Tab. 23).

Obwohl die Acidobacteria das abundanteste Phylum nach Proteobacteria und Actinobacteria sowohl im Grünland- (11%) als auch im Waldboden (12%) waren, scheinen sie nicht aktiv am Abbau von abgestorbenem Weizenmaterial beteiligt zu sein. Ihre Abundanz sank in den ‚schweren’ Fraktionen der ¹³C-Weizenwurzelinkubationen nach 72 h auf 1 und 3%. Selbst bei Verwendung des Acidobacteria-spezifischen Primers Acido31F (Barns et al., 1999) konnte entweder kein PCR-Produkt von ‚schweren’

Fraktionen der ¹³C-Weizenwurzel-Inkubationen nach 72 h erhalten werden oder aber die daraus resultierenden T-RFLP-Profile der 16S rRNA unterschieden sich nicht von denen der entsprechenden ‚leichten’ Fraktionen (Daten nicht gezeigt).

Die 454-Pyrosequenzierung verdeutlichte die Ergebnisse der Klonbibliotheken: im Grünland waren vor allem - und -Proteobacteria und im Wald vorrangig Actinobacteria, -Proteobacteria und Firmicutes am frühen Abbau von Weizenwurzeln im Boden beteiligt.

Tabelle 24. Phylogenetische Zuordnung der 16S rRNA-Sequenzen der 454-Pyrosequenzierung (Probenbezeichnung siehe Tab. 23). Der prozentuale Anteil taxonomischer Gruppen, die in mindestens einer Inkubation mit >0,5% vorkommen, ist dargestellt. Am Abbau von 13 C-markierten Weizenwurzeln beteiligte Gattungen sind fett hervorgehoben. PhylumGenusGrünlandWald 13CGH13CGL12CGH12CGL BGL13CFH13CFL12CFH12CFLBFL Iamia0,060,510,590,74 0,560,020,150,170,170,12 Solirubrobacter0,422,101,531,851,680,110,290,270,310,24 Catenulispora---- -1,130,300,420,290,33 Pseudonocardia0,090,490,730,550,670,090,170,180,110,18 Tetrasphaera0,110,540,480,51 0,430,090,040,050,040,04 Terrabacter0,020,020,020,02 0,040,510,160,160,090,11 Arthrobacter1,330,270,840,590,424,750,230,520,300,29 Agromyces1,601,011,060,91 0,730,020,010,010,010,01 Humicoccus1,131,150,950,731,013,531,551,871,271,26 Streptacidiphilus---- -8,850,930,600,480,26 Kitasatospora0,340,090,110,100,077,770,550,330,290,25 Streptomyces1,451,081,481,451,2813,870,960,830,530,77 Nocardioides0,731,021,131,031,200,050,070,030,050,09 Kribbella0,610,500,520,52 0,420,420,150,180,130,16 Marmoricola0,451,081,081,12 1,130,430,320,530,600,41 Microlunatus0,600,530,360,380,340,170,090,080,060,05

Actinobacteria Mycobacterium0,180,540,660,400,620,865,422,753,343,58 Paenibacillus0,290,070,060,080,043,030,200,070,070,10Firmicutes Bacillus0,130,440,420,430,601,410,280,080,100,08 BacteroidetesFlavobacterium0,670,130,180,200,110,010,140,100,190,12 Geobacter0,030,840,620,660,82-0,080,040,070,12 Cystobacter1,280,090,010,02 ------ Methylibium0,280,590,520,54 0,460,300,500,430,550,29 Ralstonia-0,19-- -0,900,15--- Burkholderia0,010,010,000,000,021,710,190,150,190,14 Duganella0,890,070,100,090,023,330,280,050,040,01 Massilia1,190,060,110,12 0,010,520,060,010,01- Janthinobacterium0,02-0,010,02 0,011,540,140,020,020,01 Herbaspirillum0,000,020,010,02 0,001,060,140,020,010,01 Collimonas0,00--- -1,150,140,160,130,03 Variovorax0,460,180,200,21 0,171,580,280,240,310,30 Pelomonas0,190,050,070,050,010,570,080,040,05- Balneimonas0,810,450,460,460,38----- Bradyrhizobium0,761,030,891,090,950,540,880,790,990,98 Rhizobium0,110,010,060,050,010,510,030,030,020,01 Mesorhizobium0,870,330,330,32 0,360,530,150,200,170,12 Labrys0,010,020,000,000,010,900,330,260,300,16 Rhodoplanes0,150,680,610,750,620,030,330,330,290,28 Methylobacterium0,050,340,480,27 0,460,140,410,540,190,17 Defluviicoccus0,140,971,000,961,28-0,010,010,00- Paracoccus0,130,010,590,02 0,01--0,030,010,02 Amaricoccus1,920,450,320,260,340,050,010,040,030,03 Pseudomonas0,340,030,010,060,040,570,360,020,050,05 Proteobacteria Steroidobacter0,090,590,410,550,800,010,170,160,160,16 Spartobacteriagenerainc.sed.0,050,320,530,260,350,042,190,541,431,37Verrucomicrobia Subdivision3generainc.sed.0,050,750,820,500,720,011,720,371,581,13 PlanctomycetesSingulisphaera0,020,430,430,41 0,650,321,400,980,992,04

Nicht aktiv beteiligt waren dagegen in beiden Böden Acidobacteria, -Proteobacteria, Planctomycetes, Verrucomicrobia und Gemmatimonadetes. Der Vergleich des klassischen und ‚next-generation’ Verfahrens zur Identifizierung von Bodenbakterien, die aktiv an der Assimilierung von Kohlenstoff aus Weizenpflanzenmaterial beteiligt sind, zeigte, dass alle wichtigen und abundanten bakteriellen Phyla in den Sequenzen der Klonbibliotheken als auch durch Pyrosequenzierung detektiert werden konnten. Nur wenn die Sequenzdaten bis auf die Ebene von Bakteriengattungen, die am Abbau von Weizenwurzeln in den beiden Böden beteiligt waren, analysiert wurden, konnten durch die vielfach höhere Sequenzanzahl mehr Erkenntnisse aus der Pyrosequenzierung erlangt werden. Die Sequenzdaten der Klonbibliotheken hingegen erlaubten über in silico T-RFLP-Analyse eine Zuordnung der abundanten T-RFs zu bakteriellen Populationen.

Im Dokument Phylogenetische und funktionelle Diversität von Acidobacteria in Wald- und Grünlandböden unterschiedlicher Landnutzung (Seite 105-122)