2 K ENNTNISSTAND
2.4 Hydroxybenzylphosphonat-Pro-Oligonucleotide
T
O O P S
O HO
O T
O OH O
R O
T
O O P S
O HO
O T
O OH HO
O
T
O O P S
O HO
O T
O OH
Carboxyesterase
R= t-Bu , i-Pr, Me
Abbildung 8 Pro-Oligonucleotid Konzept von IYER et al.
Die α-Hydroxybenzylphosphonat-modifizierten Prodrugs unterliegen einem chemischen Abbau und setzen dabei nicht-toxische Benzylalkohole bzw. Benzaldehyde frei. Wie in früheren Arbeiten gezeigt werden konnte, unterliegen α-Hydroxybenzylphosphonate in wässrigen, alkalischen Medien zwei unterschiedlichen Abbauwegen.67,70 Welcher Reaktionsweg eingeschlagen wird, hängt von den elektronischen Eigenschaften des Substituenten R am Aromaten ab. Akzeptorsubstituenten (z.B. NO2) begünstigen die Phosphonat-Phosphat-Umlagerung (A), während Donorsubstituenten (z.B. OMe, Me) eine Rückspaltung (B) begünstigen (Abbildung 9).
Eine Erklärung für die unterschiedlichen Abbauwege liefert der in Abbildung 10 dargestellte Abbaumechanismus. Bei der Phosphonat-Phosphat-Umlagerung (A) wird zunächst die α-Hydroxybenzylgruppe deprotoniert und das freie Elektronenpaar des negativ geladenen Sauerstoffatoms greift nucleophil unter Bildung eines Oxaphosphirans am Phosphoratom an. Nach heterolytischem Bruch der P-C-Bindung entsteht ein Benzylcarbanion, welches durch Akzeptorsubstituenten im Arylrest, wie z.B. NO2, in ortho-oder para-Position stabilisiert wird. Durch diese Stabilisierung liegt das Gleichgewicht auf der Seite des Benzylphosphattriesters. Die anschließende Reprotonierung ist irreversibel und führt zum Benzylphosphattriester. Der Benzylrest stellt die labilste Phosphatestergruppe dar und wird durch wässrige Hydrolyse zum entsprechenden Benzylalkohol und Phosphatdiester gespalten.
Eine Konkurrenzreaktion zur Phosphonat-Phosphat-Umlagerung ist die Hydrolyse über die Rückspaltungsreaktion (B). Dabei wird das α-Hydroxybenzylphosphonat zunächst wieder an der α-Hydroxybenzylgruppe deprotoniert. Anschließend zerfällt das Intermediat durch heterolytischen P-C-Bindungsbruch in ein Benzaldehyd und das Anion des Phosphonatdiesters. Reprotonierung führt zum H-Phosphonatdiester. Dieser ist unter den alkalischen Bedingungen instabil und die nachfolgende Hydrolyse führt zur Bildung des H-Phosphonatmonoesters. Möglicherweise kann der H-Phosphonatdiester auch zum Phosphatdiester oxidiert werden. Diese Rückspaltung sollte bevorzugt ablaufen, wenn der Arylrest Carbanionen destabilisiert, also donorsubstituiert ist.
P ONuc O
ONuc O R
O P ONuc O
ONuc R
H
P ONuc O
ONuc O R
H
O P ONuc O
ONuc R
A
B
P ONuc O
ONuc H OH
P ONuc O
ONuc H OH
P ONuc O
ONuc O R
H
R O
H P ONuc O
ONuc P
ONuc O
ONuc O P
ONuc O
ONuc
OH R
H P O O
ONuc R
R Base
Reproto-nierung
Base
Reprotonierung
Hydrolyse
+ Nucleosid
Abbildung 10 Abbaumechanismen der 5‘,5‘-Dinucleosyl-α-hydroxybenzylphosphonate Die Idee des Pro-Oligonucleotid Konzeptes bestand nun darin, diese Eigenschaften auf Antisense-Oligonucleotide zu übertragen. Durch Einfügen der α-Hydroxybenzylgruppe in das Phosphatrückgrat eines DNA-Stranges ist es gelungen, einen neuen Ansatz für Pro-Oligonucleotide zu entwickeln.71,72-7374 Eine Variation des Arylrestes erlaubt die Halbwertszeit der angestrebten Umlagerung des α-Hydroxybenzylrestes und des anschließenden Zerfalls des Benzylphosphattriesters zu beeinflussen. In früheren Arbeiten ist es gelungen, dieses Konzept erfolgreich auf Thymidin-Oligonucleotide (dT)15
anzuwenden und deren Eigenschaften zu untersuchen.72 Tests dieser Oligonucleotide gegen Exonucleasen zeigten, dass bereits durch die Einführung von nur einer
α-Hydroxybenzylphosphonat-Einheit in das Rückgrat eines Oligonucleotids eine deutliche Stabilitätserhöhung im Vergleich zu den unmodifizierten Oligonucleotiden erreicht wird. Eine α-Hydroxybenzylphosphonat-Modifikation am 5‘-Ende erhöhte die Resistenz gegen 5‘-Exonucleasen um das 30-fache während eine Modifikation am 3‘-Ende die Stabilität gegen 3‘-Exonucleasen um das 6-bis 18-fache erhöhte. Bei Einbau stereoisomerenreiner α-Hydroxybenzylphosphonat-Einheiten (bezüglich des Phosphoratoms) wurde für das RP-Isomer eine größere Stabilität gefunden als für das SP -Isomer.
3 AUFGABENSTELLUNG
In vorangegangenen Arbeiten von R.P. MAURITZ wurde das
α-Hydroxybenzylphosphonat-Pro-Oligonucleotidkonzept für Thymidinoligonucleotide als Modellsystem entwickelt und erste Untersuchungen zu deren Eigenschaften konnten durchgeführt werden.
Ziel dieser Arbeit war es nun Konzepte zu entwickeln, um diese Modifikation in biologisch relevante, also gemischte Sequenzen, einzubauen. Hierfür sollten zunächst für eine anti H-ras ODN 1 3,75 und eine anti Influenza Sequenz ODN 2 76 (ODN= Oligo-2’-desoxyribonucleinsäure) dimere Adenosyl-Thymidyl-Bausteine 1& 2RP,SP synthetisiert werden, welche anschließend als 3’-Phosphoramidit 3RP,SP, bzw. an eine feste Phase (CPG) gebunden 4RP,SP in der automatisierten Festphasensynthese eingesetzt werden sollten (Abbildung 11).
N N N N
NHBz
O
O DMTrO
P O
OR O O
HN N O
O NO2
FpmpO
R=
O O
P N NC O
O
NH O
CPG 5'-TPAPTPTPCPCPGPTPCPAPT-3'
HO O2N 5'-TPAPTPTPCPCPGPTPCPAPT-3'
HO O2N
5'-TPAPTPTPCPCPGPTPCPAPT-3'
HO O2N HO
O2N
anti H-Ras
5'-APAPGPAPAPAPGPGPTPAPTPAPAPCPTPTPAPTPAPT-3'
HO O2N 5'-TPAPTPTPCPCPGPTPCPAPT-3'
5'-APAPGPAPAPAPGPGPTPAPTPAPAPCPTPTPAPTPAPT-3' anti Influenza
ODN 1
sense H-Ras
5'-APTPGPAPCPGPGPAPAPTPA-3'
ODN 2
ODN 3 ODN 4
ODN 5
ODN 8
5'-APTPAPTPAPAPGPTPTPAPTPAPCPCPTPTPTPCPTPT-3'
ODN 6
ODN 7
1
H 2
3
4
Abbildung 11 Zielsequenzen und dimere Synthesebausteine
Die so synthetisierten α-Hydroxybenzylphosphonat-Oligonucleotide ODN 3-4,8 RP,SP
sollten auf Ihre chemischen Eigenschaften, wie thermodynamische Daten (Tm-Wert, ∆G,
∆H, ∆S) untersucht und deren Stabilität gegenüber Nucleasen bestimmt werden. In Abhängigkeit von der Stereochemie des Phosphonatzentrums wurden unterschiedliche Tm-Werte der modifizierten ODN gefunden. Diese Beobachtung sollte auch in dieser Arbeit an gemischen Sequenzen untersucht werden, so dass die Diastereomere bezüglich des Phosphonates getrennt erhalten und eingesetzt werden mussten.
Die Modifikation über modifizierte dimere Bausteine in die ODN einzubringen bietet den entscheidenden Vorteil, die Stereochemie bezüglich des Phosphonates kontrollieren zu können. Sollen allerdings eine Vielzahl biologisch relevanter Sequenzen synthetisiert und getestet werden, so wären 16 verschiedene Bausteine notwendig, deren Synthese lang, aufwendig, unflexibel und kostenintensiv ist. Außerdem ist nur jede 2. Position in potentiellen Antisense-Pro-Oligonucleotiden modifizierbar. Daher war ein weiteres Ziel dieser Arbeit einen Syntheseweg zu modifizierten monomeren
α-Hydroxybenzylphosphonamiditen der Struktur 5 (Abbildung 12A) zu finden, um diese analog zu den Standardphosphoramiditen in der DNA-Synthese einsetzen zu können.77 Mit dieser Methode wäre die Synthese von nur 4 modifizierten Bausteinen notwendig, welche flexibel in jede beliebige DNA-Sequenz eingebaut werden könnten.
A
O
T
O DMTrO
P N SGO
NO2
SG= Fpmp (a) , THP (b) , TBDPS (c) 5
B
R1 P R2
O SGO
O2N
R1=R2= a OPh b OEt c OH(NEt3) d Cl H
Fpmp DHP TBDPS 6
7 8 9
SG=
R1= O(HNEt3), R2= H SG=
10 TBDPS 11 Fpmp
Abbildung 12 A: Monomerer α-Hydroxybenzylphosphonamidit Baustein 5 B: Dimerer
α-Hydroxy-2-nitrobenzylphosphonat Precursor 6-9 und α -Hydroxy-2-nitrobenzylphosphinat Precursor 10,11
Die Synthese der modifizierten dimeren Bausteine ist langwierig, aufwendig und unflexibel. Man ist bereits zu Beginn der Synthese auf eine bestimmte Nucleosidkombination festgelegt und muß fast alle Syntheseschritte am Phosphonatdinucleotid durchführen. Es sollten neue Synthesemöglichkeiten zu diesen
Dinucleotidbausteinen gefunden werden, welche nicht wie die herkömmliche Synthese ausgehend von den Nucleosiden die Verbindung aufbaut, sondern über Hydroxy-2-nitrophenylmethyl-phosphonat Precursor 6-9, bzw. Hydroxy-2-nitrophenylmethyl-phosphinat Precursor 10,11 in zwei abschließenden Schritten mit den Nucleosiden gekuppelt werden können. Hierfür müssen verschiedene geschützte α -Hydroxy-2-nitrobenzylphosphonat und -phosphinatdiester synthetisiert und auf Ihre Reaktivität untersucht werden. Für diese Reaktionen sollten verschiedene für H-Phosphonate entwickelte Reaktionen (Kupplungsreaktionen, Pudovic-Addition, Atherton-Todd-Reaktion) auf deren Übertragbarkeit auf Phosphinate untersucht und so erweiterte Möglichkeiten in der Phosphonat-, bzw. Phosphinatchemie geschaffen werden.
4 RESULTATE UND DISKUSSION