2.8 Hybridisierung von Hefestämmen
Für die Optimierung von Brauhefestämmen ist die Anwendung von gentechnischen Methoden zu gezielten Veränderungen von Genen bzw. Eigenschaften bei industriell eingesetzten Mikroorganismen nicht erlaubt. Durch die Mutagenese können zwar in-dustriell zugelassene Hefeoptimierungen durchgeführt werden, diese sind jedoch sehr willkürlich und ungerichtet. Es erfordert einen hohen Aufwand die „richtige“ Hefe zu finden. Dadurch erschwert sich die Vereinigung vieler positiver Eigenschaften in einer Hefe. Eine weitere zugelassene Methode wäre das Kreuzen bzw. Hybridisieren von zwei Hefestämmen. Stämme mit den jeweiligen positiven Eigenschaften könnten ge-kreuzt werden. Eventuell erhält man so einen in seinen Fermentationseigenschaften aufgewerteten Stamm. Die jeweiligen optimalen Eigenschaften der jeweiligen Hefen, könnten eventuell so in einer Hefe vereint werden.
Die Hybridisierung von Wein- und Brauhefen könnte daher eine mögliche Option zur Stammoptimierung darstellen. Bei den für das High-Gravity-Brewing gescreenten He-fen handelte es sich hauptsächlich um WeinheHe-fen. Einige von diesen HeHe-fen waren für das High-Gravity-Brewing vor allem bei 14 °C besser geeignet als der verwendete Re-ferenzstamm (untergärige Brauhefe). Da es sich jedoch um Weinhefen handelte, war das Aromaspektrum des entstandenen Produktes nicht typisch für Bier. Die könnte eventuell durch die Kreuzung mit einer Brauhefe optimiert werden.
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Durch die Hybridisierung der Weinhefe mit der Brauhefe könnten verbesserte Fermen-tationseigenschaften wie die Gärung bei 14 °C bei 25 °P durch die Weinhefe und ein verbessertes Bieraroma durch die Bierhefe vereint werden.
Erste Schritte wurden im Rahmen des Projektes schon durchgeführt. Dazu müssten erst einmal Sporen der jeweiligen zu kreuzenden Hefen erzeugt werden. Da untergäri-ge Brauhefe schon Hybride mit einem alloploiden Chromosomensatz sind, erweist sich die Sporenbildung als schwierig bzw. langwierig. Erste Versuche konnten hier schon mit verschiedenen aus der Literatur entnommenen Medien durchgeführt werden.
Weinhefen sporulierten schon nach 2 – 3 Tagen auf den jeweiligen Medien, so dass eine Massensporenisolation durchgeführt werden konnte. Untergärige Brauhefen zeig-ten erst nach ca. 28 Tagen vereinzelte Sporulationen. Da die Sporen hier nur verein-zelt auftraten, mussten diese mit einem Mikromanipulator isoliert werden. Nach erfolg-reicher Isolation müssen die Sporen auf ihren verringerten Chromosomensatz und ihren Kreuzungstyp (a oder α) hin überprüft werden.
Die Kreuzungstypen können durch den Kreuzungslocus MAT mittels PCR bestimmt werden. Solch eine PCR ist in Abbildung 47 dargestellt. Die Originalstämme (welche ursprünglich aus einer Kreuzung entstanden sind) weisen aufgrund ihres mehrfachen Chromosomensatzes beide Kreuzungstypen auf. Die Sporen sollten nur einen Kreu-zungstyp, a oder α, und demnach nur eine Bande aufweisen. In der Abbildung 47 ist jedoch zu erkennen, dass auch die Sporen beide Paarungstypen aufweisen können.
Die Ursache hierfür liegt in einem Paarungstyp-Determinationswechsel. Der zentrale, einzig aktive Locus ist MAT, auch Paarungstyplocus genannt, der von den Loci HMLα und HMRa umgeben wird (Kassettenmodell). Das aktive Gen am MATlocus kann her-ausgeschnitten und durch eine neue synthetisierte Kopie des stummen Locus, der den neuen Paarungstyp bestimmt, ersetzt werden. Obwohl das ursprüngliche Gen am MATlocus herausgeschnitten wurde, verbleibt eine stumme Kopie im Genom und macht den Wechsel dadurch reversibel [Alberts et al., 2011; Passarge, 2008]. Daher können die Zellen, die aus einer Spore entstanden sind und demnach nur einen Kreu-zungstyp besitzen sollten, innerhalb einer Kolonie verschiedene KreuKreu-zungstypen auf-weisen. Dies macht sich durch zwei Banden nach der PCR bemerkbar. Daher müssen die Sporen vor der Hybridisierung auf einen einzelnen aktiven Paarungstyp hin über-prüft werden.
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Ob es sich bei einem doppelten Paarungstyp trotzdem um eine Spore handelt, kann mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Der Chromosomensatz bzw. der DNA-Gehalt einer Hefezelle kann mittels Durchflusszytometrie überprüft werden. Die Zellen bzw. die DNA werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff angefärbt. Die Fluo-reszenzintensität der jeweiligen Originalzellen bzw. der Sporen können so miteinander verglichen werden. Die Sporen sollten einen geringen DNA-Gehalt aufgrund des hal-bierten Chromosomensatzes besitzen. Demnach ist ihre Fluoreszenzintensität gerin-ger (siehe Abbildung 48).
Abbildung 47: MATlocus PCr zur Bestimmung des Kreuzungstyps einer Hefe. Aufgetragen ist der Ausgangsstamm (Ori), der beide Kreuzungstypen besitzt und die jeweiligen isolierten Sporen (1-10).
Die Bande um 500bp stellt den Kreuzungstyp a dar, während die Bande um 400 bp den Kreuzungstyp α darstellt.
Abbildung 48: Analyse des DNA-Gehalts der Weinhefe und ihrer jeweiligen Sporen a und α mittels Durchflusszytometrie.
Erste Kreuzungsversuche wurden durchgeführt, deren Erfolg jedoch noch überprüft werden muss. In weiterführenden Forschungsprojekten zur Optimierung von Hefe-stämmen soll dieser Ansatz weiterhin verfolgt werden.
79,6
57,4
40,6
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0
WH Original WH Spore MATα WH Spore MATa
Fluoreszenzintensität (Mean)
Ori 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MAT a MAT α
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3 Zusammenfassung
Für die Gärung des High-Gravity-Brewing werden angepasste Hefen benötigt. Dabei ist vor allem auch der Endvergärungsgrad von Interesse. In diesem Projekt wurden Hefen, die ursprünglich nicht in der Brauerei verwendet werden, auf ihre Eignung fürs High-Gravity-Brewing hin untersucht. Dazu zählen nicht-Saccharomyces-Hefen wie z.
B. Schizosaccharomyces und Saccharomyces-Hefen wie Weinhefen, Brennereihefen und Backhefen. Ein anfängliches Screening hatte vornehmlich die Verwertung von hohen Maltosekonzentrationen im Focus. Die Gärversuche deuteten darauf hin, dass für die Gärung von High-Gravity-Würze auch eine untergärige Brauhefe bei einer Gä-rung bei 26 °C geeignet ist und sogar einen geringeren Restextrakt erreicht als die gescreenten Weinhefen, welche eigentlich aufgrund ihres Ursprungs an Substrate mit hohem Extraktgehalt gewohnt sind. Da sie aber an unterschiedliche Zucker adaptiert sind, zeigt die Brauhefe trotz der hochkonzentrierten Würze bei hohen Temperaturen eine gute Gärperformance. Es stellte sich heraus, dass auch die Fähigkeit auf Maltotrioseverwertung mit berücksicht werden sollte, da Weinhefen nicht zwingend in der Lage sind, Maltotriose zu verwerten. Schließlich konnten maltotrioseverwertende Hefen gescreent und eingesetzt werden. Dabei stellte sich heraus, dass ihre Fermen-tationsperformance in 25 °P Würze bei 14 °C durchaus besser war, als die einer un-tergärigen Brauhefe.
Weiterhin wurden Optimierungsversuche von Hefestämmen mittels Mutagenese durchgeführt. Gezielt gentechnisch veränderte Hefen dürfen in Deutschland für den industriellen Einsatz nicht verwendet werden. Hefen, deren genetischer Hintergrund durch Mutagenese verändert wurde, können jedoch eingesetzt werden. Die Mutagenese ist allerdings sehr willkürlich und aufwändig in der Findung der richtigen Mutante. Da die Mutationen in diesen Fällen ungerichtet sind, könnten zwar positive Aufwertungen der jeweiligen Mutante beobachtet werden, die Eigenschaften können sich aber auch für den Prozess verschlechtern. Mutanten mit geringfügig verbesserten Eigenschaften im Vergleich zum Ausgangsstamm konnten gefunden werden, es be-steht jedoch noch Potential, durch umfassendere Studien mit mehr erzeugten Mutan-ten KandidaMutan-ten zu detektieren, deren brauereirelevanMutan-ten EigenschafMutan-ten inMutan-tensiver verbessert werden.
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Für die gezielte Optimierung der Gärgeschwindigkeit bzw. des Endvergärungsgrades können 2-Desoxy-Glucose-Klone isoliert werden. Diese können Maltose und Glucose parallel verwerten und verbrauchen. Dies bedeutet, dass sie die sog. Glucose-Repression nicht aufweisen, durch die in Anwesenheit von mehreren Zuckern immer zuerst Glucose verwertet wird. Bei einer Glukose-Derepression werden Zucker parallel abgebaut, wodurch die vorhandenen Zucker schneller abgebaut werden können. Es konnten erfolgreich solche Klone isoliert werden, die den Extrakt etwas mehr und schneller abbauten als der Ausgangsstamm. Jedoch ist auch hier die Isolierung recht willkürlich, denn auch hier bedeutet nicht jede Isolierung auf dem jeweiligen 2-Desoxy-Glukose-Medium zwangsläufig, dass die isolierten Hefen eine Glukose-Derepression aufweisen.
Ein Scale up der Fermentationen mit den isolierten (Maltotriose positiven) Hefen er-wies sich als schwierig, da sie nicht die gleiche Fermentationsperformance wie in den EBC-Säulen zeigten. Die Hefen zeigten im Vergleich zu dem kleineren Maßstab ge-ringere Endvergärungsgrade auf. Weitere ZIM-Forschungsprojekte mit Kooperations-partnern diesbezüglich sind weiterhin angestrebt.
Da bei der Optimierung von Hefestämmen durch ungerichtete Mutagenese die jeweili-gen Mutanten nicht nur verbesserte, sondern auch verschlechterte Eijeweili-genschaften aufweisen können, wäre eine Alternative zu den ungerichteten Optimierungen eine Kreuzung von zwei verschiedenen Hefestämmen, um positive Eigenschaften in einer Hefezelle zu vereinen. Hier würde sich z. B. die Kreuzung von einer Weinhefe mit ei-ner Brauhefe anbieten. Dabei könnte vor allem das Aromaspektrum für die Bierherstel-lung optimiert werden, da Weinhefen alleine hauptsächlich ein fruchtiges Aroma er-zeugen. Dazu müssen zuerst von den jeweils zu kreuzenden Hefen Sporen isoliert werden. Da die Brauhefe jedoch einen alloploiden Chromosomensatz aufweist, stellt diese bei der Gewinnung von Sporen, eine Herausforderung dar. Erste Versuche diesbezüglich konnten im Rahmen dieses Forschungsprojektes durchgeführt werden.
In weiterführenden Forschungsprojekten soll dieses Ziel weiterhin verfolgt werden.
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5 Veröffentlichungen
Vorträge:
4th Iberoamerican VLB Symposium - Brewing and Filling Technology, 2013: Very high gravity brewing: “Strategies for yeast selection”, Thomas Tyrell
Beitrag im Rahmen des Technisch-Wissenschaftlichen Ausschusses (TWA) auf der 101. Oktobertagung der VLB, 2014: “Selection of yeast for High Gravity Brewing”, Prof.
U. Stahl
Poster-Präsentation:
European Brewery Convention, 2015: “New workers in the brewery - Selection of new yeast to improve High Gravity Brewing”, Cöllü, I.; Uhde, C.; Lorenz, E.; Stahl, U.; Pahl, R.; Bilge, D.
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6 Verwendung der Zuwendung
Die Zuwendung wurde wie folgt verwendet:
a. Wissenschaftlich-technisches Personal (Einzelansatz A.1 des Finanzie-rungsplans)
Forschungsstelle 1: BBSA/FIGBP
Arbeitsschritt Eingesetzte Per-sonenmonate
Arbeitsschritt 1 2
Arbeitsschritt 2 2,4
Arbeitsschritt 3 2,8
Arbeitsschritt 4 2,1
Arbeitsschritt 5 2,7
Arbeitsschritt 6 3,5
Arbeitsschritt 7 5,4
Dokumentation 1
Forschungsstelle 2: Mikrobiologie
Arbeitsschritt Eingesetzte Per-sonenmonate
Arbeitsschritt 1 2
Arbeitsschritt 2 1
Arbeitsschritt 3 0,5
Arbeitsschritt 4 2,35
Arbeitsschritt 5 4,15
Arbeitsschritt 6 4,5
Arbeitsschritt 7 4
Dokumentation 1
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b. Übriges Fachpersonal (Einzelansatz A.2 des Finanzierungsplans) Forschungsstelle 1: FIGBP
Arbeitsschritt Eingesetzte Per-sonenmonate
Arbeitsschritt 1 0,7
Arbeitsschritt 2 0,3
Arbeitsschritt 3 0
Arbeitsschritt 4 1
Arbeitsschritt 5 5,25
Arbeitsschritt 6 3,4
Arbeitsschritt 7 2,4
Dokumentation 0
Forschungsstelle 2: Mikrobiologie
Arbeitsschritt Eingesetzte Perso-nenmonate
Arbeitsschritt 1 2,5
Arbeitsschritt 2 3,5
Arbeitsschritt 3 4
Arbeitsschritt 4 3,75
Arbeitsschritt 5 5,5
Arbeitsschritt 6 5,05
Arbeitsschritt 7 3,3
Dokumentation 0
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7 Notwendigkeit und Angemessenheit der geleisteten Arbeit
Die Ergebnisse und der dargestellte Aufwand entsprechen dem begutachteten und bewilligten Antrag. Die abgerufenen Mittel sind als angemessen zu betrachten.
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8 Plan zum Ergebnistransfer in die Wirtschaft
Maßnahme Ziel Zeitpunkt
Treffen des Projektbegleiten-den Ausschusses
Veröffentlichung der Ergebnis-se der Literaturrecherche in einer deutschsprachigen Fach-zeitschrift
Schaffung einer Refe-renzquelle für alle inte-ressierten Unternehmen
Brauwelt 6/2014, 130-133
- Nächste VÖ geplant III/2015
Vortrag über das Forschungs-projekt auf einer Fachtagung der VLB, vorzugsweise auf der seit über 100 Jahren jährlichen stattfindenden Oktobertagung
Information eines gro-ßen Fachpublikums:
200 – 300 Zuhörer
Innerhalb eines Jahres nach Ende des Projek-tes
Veröffentlichung des Ab-schlussberichtes auf der Inter-netseite der VLB
Bereitstellung tiefer ge-hender Information im Internet
Innerhalb eines halben Jahres nach Ende des Projektes
Veröffentlichung der Ergebnis-se des Forschungsprojektes in einer deutschsprachigen Fach-zeitschrift, vorzugweise Brauwelt, Brauereiindustrie oder Brauerei Forum
Information eines präsentati-onsfähiger
Forschungs-Nach Veröffentlichung der Ergebnisse
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ergebnisse zur Einbin-dung in die AusbilEinbin-dung von Brautechnologen an der Technischen Univer-sität Berlin und an der VLB
Beratung von Unternehmen
Einbindung der For-schungsergebnisse in die Beratung von Unter-nehmen durch die VLB
Ab dem Zeitpunkt zu dem umsetzbare For-schungsergebnisse erzielt wurden.
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9 Darstellung des wissenschaftlich-technischen und wirtschaftlichen Nutzens der erzielten Ergebnisse insbesondere für KMU sowie ih-res innovativen Beitrags und ihrer industriellen Anwendungsmög-lichkeiten
Mit den Ergebnissen des Forschungsvorhabens können klein- und mittelständische Brauereien bei der Anwendung von High Gravity Brauverfahren, insbesondere unter Verwendung brauuntypischer Hefestämme wie Nicht-Saccharomyces Spezies sowie Wein-und Destillierhefen, unterstützt werden.
Die Forschungsergebnisse konnten die Schwierigkeiten aufzeigen, tendenziell osmotolerante Hefen auf dem Substrat Würze gären zu lassen, wenn diese nicht an die optimale Verwertung der Kohlenhydrate adaptiert sind. Durch strukturierte Studien konnte dabei dargestellt werden, dass der Einfluss des Substrates eine übergeordnete Rolle bei Hefe-Fermentationsprozessen mit dem Ziel einer hohen Alkoholausbeute, besitzt.
Gerade kleine und mittelständische Brauereien, welche aufgrund beschränkter finan-zieller Möglichkeiten keine eigenen Forschungs- und Entwicklungsarbeiten zum High Gravity Prozess leisten können, werden dadurch in die Lage versetzt, bei Prozess- und Produktentwicklungen mit neuartigen Rohstoffen oder innovativen Hefen auf die hier erzielten Kenntnisse zurückgreifen zu können, wodurch in der Praxis entstehende Fehlentscheidungen und damit nachteilige finanzielle Folgen vermieden werden kön-nen.
Weiter wurden Ansätze für potentielle Weiterentwicklungen, so z.B. die gezielte Kreu-zung von Brau- mit Weinhefen zur verbesserten Anpassung an den Brauprozess mit Würze, aufgezeigt. Durch Realisierung solcher Ansätze können Nischen für kleine und mittelständische Brauereien entstehen, die mit dem anhaltenden Trend unkonventio-neller Brauprozesse konform sind.
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Im Rahmen des Forschungsprojektes konnten zudem vielversprechende Ergebnisse mit Nicht-Brauhefen, welche Maltotriose verwerten können, erzielt werden. Die dabei vielversprechendsten Fermentationsleistungen unter Verwendung einer 25 °P Würze und einer Temperatur von 14 °C bieten Ansatzmöglichkeiten für eine Implementierung neuartiger Brauprozesse, die ebenfalls eine interessante Nische für gerade kleineren Brauereien liefern könnte.
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10 Einschätzung zur Realisierbarkeit des vorgeschlagenen und aktua-lisierten Transferkonzepts
Erste Schritte zum Ergebnistransfer sind während der Projektlaufzeit durchgeführt worden. Weitere Maßnahmen zur Verwertung und Verbreitung der Projektergebnisse sind im Anschluss an das Projekt vorgesehen. Über den Austausch zwischen For-schungsstellen und Unternehmen des projektbegleitenden Ausschusses sowie weite-ren interessierten Unternehmen hat bereits ein Wissenstransfer stattgefunden.
Nach Einschätzung der Forschungsstellen ist die Einbringung von aktuell nicht in der Brauerei eingesetzten Hefen zur Optimierung von High-Gravity-Brewing in heutigen Systemen umsetzbar. Die Ansprache potenziell interessierter Unternehmen erscheint daher sinnvoll und realisierbar.
Die Veröffentlichung der Ergebnisse der Literaturrecherche in einer deutschsprachigen Fachzeitschrift soll im Zusammenhang mit der Veröffentlichung der Ergebnisse in ei-ner Fachzeitschrift inei-nerhalb eines Jahres nach Projektabschluss erfolgen.
Vorstellung des Forschungsvorhabens im Technisch Wissenschaftlichen Ausschuss der VLB wurde realisiert als Beitrag im Rahmen des Technisch-Wissenschaftlichen Ausschusses (TWA) auf der 101. Oktobertagung der VLB, 2014: “Selection of yeast for High Gravity Brewing”, gehalten von Prof. Dr. U. Stahl.
Weitere Inhalte des Forschungsprojektes werden am 6. Oktober 2015 auf der Okto-bertagung der VLB präsentiert.
Die Veröffentlichung des Abschlussberichtes auf der Internetseite der VLB wird im 4.
Quartal 2015 realisiert.
Die Veröffentlichung der Ergebnisse des Forschungsprojektes in einer deutschspra-chigen Fachzeitschrift, vorzugweise Brauwelt, Brauereiindustrie oder Brauerei Forum findet innerhalb eines Jahres nach Projektabschluss statt.
Die Übernahme der Ergebnisse in die Lehre ist erfolgt. Die Ergebnisse werden in den laufenden Seminaren und Ausbildungsgängen der VLB e.V. als Lerninhalt vermittelt.
Die Ergebnisse des Projekts werden bei der Beratung von Unternehmen, die durch die VLB e.V. weltweit durchgeführt werden, einbezogen und tragen dazu bei, die
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schaftlich-technische Qualität der Beratungen auf einem anerkannt hohen Level zu halten.
Insgesamt erscheint das Konzept zum Transfer der Projektergebnisse als realisierbar und wird von den Forschungsstellen wie geplant verfolgt.
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11 Angaben über gewerbliche Schutzrechte
Im Rahmen des Projekts wurden durch die VLB e.V. keine gewerblichen Schutzrechte angemeldet.
12 Förderhinweis
Das IGF-Vorhaben 16713N der Forschungsvereinigung „Brauerei“ wurde über die Ar-beitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen „Otto von Guericke“ e. V.
(AiF) im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen
(AiF) im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen