Ergebnisse
4.2 HO-1-Induktion auf Proteinebene
Mit Hilfe der Western-Blot-Technik sollte der Frage nachgegangen werden, ob die erhöhte Transkription der HO-1 durch PPIs auch eine vermehrte HO-1-Proteinsynthese zur Folge hat. Dazu wurden humane Endothelzellen (ECV 304) und murine Makrophagen (J774) mit den angegebenen Substanzen in verschiedenen Konzentrationen bzw. zu unterschiedlichen Zeitpunkten inkubiert und anschließend wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. Als Positivkontrolle diente in jedem Experiment der bekannte HO-1-Induktor CdCl2 (10 µM, nicht dargestellt).
4.2.1 Konzentrationsabhängige Effekte auf die Induktion des HO-1-Proteins in Endothelzellen
Humane Endothelzellen wurden zunächst mit Lansoprazol (10-100 µM) und Omeprazol (30-300 µM) inkubiert. Dabei war sowohl für Lansoprazol als auch für Omeprazol eine konzentrationsabhängige Induktion der HO-1-Proteinexpression detektierbar (Abb. 13).
Mit beiden PPIs konnte eine maximale knapp 3fache Stimulation der HO-1-Proteinsynthese gegenüber den unbehandelten Kontrollen erreicht werden.
Lansoprazol zeigte jedoch insgesamt eine stärkere Potenz zur Induktion des HO-1-Proteins, da das Maximum der Stimulation bereits bei 100 µM erreicht wurde.
Höhere Substanzkonzentrationen konnten die Proteinbildung nicht steigern (nicht dargestellt). Signifikante Effekte von Lansoprazol waren ab einer Konzentration von 50 µM zu beobachten (Abb. 13A). Bei Omeprazol hingegen konnten signifikante Effekte erst in einer Konzentration von 100 µM sowie eine maximale Stimulation erst mit 300 µM erzielt werden (Abb. 13B).
Das verwendete Lösungsmittel DMSO hatte eine maximale Konzentration von 1 µl/ml im Reaktionsansatz und zeigte in diesem und den folgenden Experimenten zur HO-1-Proteininduktion keine Eigeneffekte (Abb. 13B).
Lansoprazol (µM) Lansoprazol (µM)
HO-1 Protein
KON 10 30 50 100
A
B
Abbildung 13: Effekt von Lansoprazol (A) und Omeprazol (B) auf die Induktion des HO-1-Proteins in Endothelzellen.
Repräsentative Western-Blots mit densitometrischer Auswertung. ECV304-Zellen wurden 8 Stunden mit Lansoprazol (10-100 µM) oder Omeprazol (30-300 µM) inkubiert. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM von n=3-6 Einzelexperimenten. * p<0,05 Inkubation vs. Kontrolle (KON); einseitige ANOVA und Bonferroni´s multipler Vergleichstest.
Induktion des HO-1-Proteins
KON 10 30 50 100
Lansoprazol (µM) 0
1 2 3
1,2×
1,51×
1,99×
2,81×
*
*
1×
HO-1 Protein
KON 10 30 50 100
Induktion des HO-1-Proteins
KON 10 30 50 100
Lansoprazol (µM) 0
1 2 3
1,2×
1,51×
1,99×
2,81×
*
*
1×
Induktion des HO-1-Proteins
KON 10 30 50 100
Lansoprazol (µM) 0
2
1 3
1,2×
1,51×
1,99×
2,81×
*
*
1×
otein HO-1 Pr Omeprazol (µM)
KON 30 50 100 300
Induktion des HO-1-Proteins
KON 30 50 100 300
Omeprazol (µM) 0
1 2 3 4
1×
1,26×
1,80×
2,46×
2,95×*
*
DMSO
HO-1 Pr Omeprazol (µM)
KON 30 50 100 300
otein
Induktion des HO-1-Proteins
KON 30 50 100 300
Omeprazol (µM) 0
1 2 3 4
1×
1,26×
1,80×
2,46×
2,95×*
*
DMSO
4.2.2 Zeitabhängige Effekte auf die Induktion des HO-1-Proteins in Endothelzellen
Weiterhin wurde der Effekt von Lansoprazol und Omeprazol auf die HO-1-Proteininduktion in Endothelzellen in Abhängigkeit von der Zeit untersucht. Dazu wurden die Zellen über einen Zeitraum von 4-24 Stunden mit der jeweiligen Substanz inkubiert.
Als Kontrolle (KON) dienten Zellen, die über 24 Stunden anstelle von PPIs mit Nüchternmedium behandelt wurden. Für beide PPIs konnte eine zeitabhängige Stimulierung der Proteinexpression gezeigt werden (Abb. 14). Eine signifikante Aktivierung der Proteinsynthese konnte für 100 µM Lansoprazol und 300 µM Omeprazol nach einer 8stündigen Inkubationszeit detektiert werden. Interessanterweise sind für Lansoprazol und Omeprazol unterschiedliche Effekte bei der zeitabhängigen HO-1-Proteininduktion zu beobachten. Während Lansoprazol im Vergleich zu Omeprazol in einer geringeren Konzentration bis zu 12 Stunden stärkere Effekte erzielte, führte eine längere Inkubationszeit (24 Stunden) bei Lansoprazol zu keiner weiteren Steigerung der HO-1-Proteinsynthese (Abb. 14A und C). Omeprazol (300 µM) erreichte hingegen erst nach 24stündiger Inkubation das Maximum an Stimulation im betrachteten Zeitraum (Abb. 14B und C).
A
B
C
Abbildung 14: Effekt von Lansoprazol und Omeprazol auf die Induktion des HO-1-Proteins in Endothelzellen.
Repräsentative Western-Blots (A, B) mit densitometrische Auswertung (C). ECV30Zellen wurden 4-24 Stunden mit 100 µM Lansoprazol oder 300 µM Omeprazol inkubiert. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM von n=3-6 Einzelexperimenten. * p<0,05 Inkubation vs. Kontrolle (KON); einseitige ANOVA und Bonferroni´s multipler Vergleichstest.
KON 4h 6h 8h 12h 24h
Lansoprazol (100 µM)
HO-1-Protein 10h
KON 4h 6h 8h 12h 24h
Lansoprazol (100 µM)
HO-1-Protein 10h
KON 4h 6h 8h 12h 24h
Omeprazol (300 µM) 10h
HO-1-Protein
KON 4h 6h 8h 12h 24h
Omeprazol (300 µM) 10h
HO-1-Protein
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
KON 4h 6h 8h 10h 12h 24h
Lansoprazol (100 µM) Omepr
* *
*
*
*
* azol (300 µM)
Induktion des HO-1-Proteins
* *
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
KON 4h 6h 8h 10h 12h 24h
Lansoprazol (100 µM) Lansoprazol (100 µM) Omeprazol (300 µM) Omepr
* *
*
*
*
* azol (300 µM)
Induktion des HO-1-Proteins
* *
4.2.3 Konzentrationsabhängige Effekte auf die Induktion des HO-1-Proteins in Makrophagen
Makrophagen zeigen eine hohe NADPH-Oxidase-Aktivität und gelten daher als eine Hauptquelle für ROS im Organismus (Griendling et al. 2000; Jankov et al. 2003; Cathcart 2004). Darüber hinaus spielen sie als Funktionseinheit des mukosalen Immunsystems eine entscheidende Rolle im Entzündungsgeschehen und scheinen besonders bei inflammatorischen Prozessen bedeutende Produzenten der HO-1 zu sein (Kampfer et al.
2001; Yachie et al. 2003). Vor diesem Hintergrund sollte der Frage nachgegangen werden, ob eine Induktion des antioxidativen HO-1-Proteins durch PPIs auch in Makrophagen möglich ist. Dazu wurden murine Makrophagen (J774) über einen Zeitraum von 8 Stunden mit Lansoprazol (5-100 µM) und Omeprazol (10-300 µM) inkubiert. Lansoprazol konnte eine signifikante Steigerung der HO-1-Proteinexpression bereits ab einer Konzentration von 50 µM erzielen (Abb. 15A). Als Maximum wurde eine 2,5fache Steigerung der HO-1-Expression gegenüber den unstimulierten Kontrollzellen mit 100 µM Lansoprazol detektiert. Stärkere Effekte konnten auch mit höheren Substanzkonzentrationen nicht erreicht werden (300µM, nicht dargestellt). Omeprazol konnte in einer Konzentration von 100 µM die HO-1-Proteinsynthese ähnlich stark induzieren (2,2fach), bei geringeren Konzentrationen waren allerdings keine signifikanten Effekte zu beobachten. Im Gegensatz zu Lansoprazol konnte mit 300 µM Omeprazol eine weitere Steigerung der HO-1-Expressionsrate provoziert werden (Abb. 15B).
Lansoprazol (µM) Lansoprazol (µM)
HO-1-Protein
KON 5 10 30 50 100
A
In
KON 5 10 30 50 100
duktion des HO-1-Proteins
Lansoprazol (µM) 0
1 2 3
1×
1,10×
1,49×
1,95×
2,40× 2,49×*
*
HO-1-Protein
KON 5 10 30 50 100
In
KON 5 10 30 50 100
duktion des HO-1-Proteins
Lansoprazol (µM) 0
2
1 3
1×
1,10×
1,49×
1,95×
2,40× 2,49×*
*
B
Abbildung 15: Effekt von Lansoprazol (A) und Omeprazol (B) auf die Induktion des HO-1-Proteins in Makrophagen.
Repräsentative Western-Blots mit densitometrischer Auswertung. J774-Zellen wurden 8 Stunden mit Lansoprazol (5–100 µM) oder Omeprazol (10–300 µM) inkubiert. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte
± SEM von n=3-6 Einzelexperimenten. * p<0,05 Inkubation vs. Kontrolle (KON); einseitige ANOVA und Bonferroni´s multipler Vergleichstest.
4.2.4 Zusammenfassung
Lansoprazol und Omeprazol aktivieren die HO-1-Proteinexpression konzentrations- und zeitabhängig in humanen Endothelzellen. Ähnliche Ergebnisse konnten auch in Makrophagen und gastralen Epithelzellen (Becker et al. 2006) erzielt werden.
Lansoprazol zeigte sich dabei als das potentere der beiden Prazole. Hinsichtlich der Effektivität und Intensität zur Proteininduktion traten in den verschiedenen Zellmodellen kaum Unterschiede auf.
4.3
HO-1-Protein Omeprazol (µM)
KON 10 30 50 100 300 DMSO
Induktion des HO-1-Proteins
Omeprazol (µM)
KON 10 30 100 300
Untersuchungen zur Viabilität
Höhere Substanzkonzentrationen oder längere Inkubationszeiten könnten möglicherweise eine toxische Wirkung haben. Um nekrotische Zellprozesse auszuschließen, wurde ein LDH-Assay durchgeführt. Die LDH-Freisetzung gilt als Marker für den nekrotischen Zelltod (Decker et al. 1988). Nach Inkubation der Zellen für 2-24 Stunden mit beiden PPIs, erfolgte die Bestimmung der LDH-Freisetzung im Zellüberstand durch photometrische Vermessung des gebildeten Formazansalzes. Die Intensität der Rotfärbung ist dabei proportional zu der Zahl der lysierten Zellen (Szekeres et al. 1981). Die Absorption der unbehandelten Kontrollzellen wurde 1 gesetzt.
KON 50
0 1 2 3 4
1×
1,18× 1,22× 1,33×
2,22×
2,77×
*
*
HO-1-Protein Omeprazol (µM)
KON 10 30 50 100 300 DMSO
Induktion des HO-1-Proteins
Omeprazol (µM)
KON 10 30 100 300
3
2
1 4
1×
1,18× 1,22× 1,33×
2,22×
2,77×
*
*
0 KON 50
4.3.1 Effekte von Omeprazol und Lansoprazol auf die Viabilität von Endothelzellen
Bis zu einer Inkubationszeit von 10 Stunden zeigten beide PPIs in der maximal verwendeten Konzentration von 500 µM in Endothelzellen keine erhöhte LDH-Freisetzung (Abb. 16). Nach 24 Stunden Inkubationszeit ist bei Lansoprazol eine signifikante LDH-Freisetzung zu beobachten. Deshalb wurde in den Experimenten der vorliegenden Arbeit eine maximale Inkubationszeit von 12 Stunden mit 500 µM Lansoprazol in Endothelzellen nicht überschritten.
Abbildung 16: Effekt von Lansoprazol (A) und Omeprazol (B) auf die LDH-Freisetzung in Endothelzellen.
ECV304-Zellen wurden 2-24 Stunden mit Omeprazol (500 µM) oder Lansoprazol (500 µM) behandelt.
Nach 24 Stunden wurde im Zellüberstand die LDH-Freisetzung gemessen. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM von n=3-6 Einzelexperimenten.* p<0,05 Inkubation vs. Kontrolle (KON); einseitige ANOVA und Bonferroni´s multipler Vergleichstest.
0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4
KON 2h 4h 6h 8h 10h 24h
4.3.2 Effekte von Omeprazol und Lansoprazol auf die Viabilität von Makrophagen
Bei Lansoprazol wurde nach 24stündiger Inkubation mit 100 µM ein signifikanter Anstieg der LDH-Freisetzung in Makrophagen beobachtet (Abb. 17A). Aus diesem Grund wurden Makrophagen in der vorliegenden Arbeit maximal über einen Zeitraum von 12 Stunden mit 100 µM Lansoprazol inkubiert. Omeprazol zeigte in den verwendeten Konzentrationen (100, 300 µM) keine vermehrte LDH-Freisetzung in Makrophagen (Abb.
17B).
A
0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3
KON 2h 4h 6h 8h 10h 24h
Lansoprazol (30 µM)
LDH-Freisetzung
*
*
Lansoprazol (100 µM)
0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3
KON 2h 4h 6h 8h 10h 24h
Lansoprazol (30 µM)
LDH-Freisetzung
*
*
Lansoprazol (100 µM) Lansoprazol (500 µM)
Omeprazol (500 µM)
LDH-Freisetzung
*
0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4
KON 2h 4h 6h 8h 10h 24h
Lansoprazol (500 µM)
Omeprazol (500 µM)
LDH-Freisetzung
*
B
Abbildung 17: Effekt von Lansoprazol (A) oder Omeprazol (B) auf die LDH-Freisetzung in Makrophagen.
J774-Zellen wurden 2-24 Stunden mit Omeprazol (100-300 µM) und Lansoprazol (30-100 µM) behandelt. Nach 24 Stunden wurde im Zellüberstand die LDH-Freisetzung gemessen Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM von n=3-6 Einzelexperimenten.* p<0,05 Inkubation vs. Kontrolle (KON); einseitige ANOVA und Bonferroni´s multipler Vergleichstest.
0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3
KON 2h 4h 6h 8h 10h 24h
LDH-Freisetzung
Omeprazol (100 µM Omeprazol (300 µM ) )
0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3
KON 2h 4h 6h 8h 10h 24h
LDH-Freisetzung
Omeprazol (100 µM Omeprazol (300 µM ) )
4.3.3 Zusammenfassung
Sowohl in Makrophagen als auch in Endothelzellen zeigte sich bis zu einer Inkubationszeit von 12 Stunden für die maximal verwendeten Konzentrationen von Lansoprazol und Omeprazol keine Zellnekrose. Eine signifikante Erhöhung der LDH-Freisetzung wurde für Lansoprazol nach einer 24stündigen Inkubationszeit beobachtet.
In Makrophagen wurde eine erhöhte LDH-Freisetzung durch Lansoprazol bereits in geringeren Konzentrationen (100 µM) im Vergleich zu den Endothelzellen (500 µM) detektiert. Dies lässt darauf schließen, dass Makrophagen ein, im Hinblick auf toxische Substanzeffekte, sensibleres Zellsystem sind. Aufgrund dieser Ergebnisse kann Zellnekrose durch mögliche toxische Effekte der PPIs in hohen Konzentrationen für die, in dieser Arbeit gewählten Untersuchungsbedingungen ausgeschlossen werden.