3.7.1 Einbettung und Herstellung von Gefrierschnitten
Für die Herstellung von 12 μm dicken Kryoschnitten wurden die Augen aus vorher perfusionsfixierten Tieren (siehe Punkt 3.6.2.1 und 3.6.2.2) entnommen und anschließend 2 h in PFA-Fixierlösung nachfixiert. PFA führt zu einer Quervernetzung von Proteinen und damit zu einer Konservierung des Gewebes zum gewünschten
Zeitpunkt (Luttmann, 2006). Nach Fixierung des Gewebes wurden die Augen dreimal mit PBS gespült um PFA-Reste aus dem Gewebe zu waschen.
Um eine Schädigung des Gewebes durch den Gefriervorgang zu vermeiden, wurden die Augen jeweils für 4 h bei RT mit unterschiedlichen Konzentrationen einer Sucrose-Lösung (10 % (w/v) Sucrose in 0,1 M Php; 20 % (w/v) Sucrose in 0,1 M Php und 30 % (w/v) Sucrose in 0,1 M Php) behandelt. Die Einbettung der Augen zur Kryokonservierung erfolgte anschließend in Tissue-Tek® direkt im Kryostat. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Augen bei –20 °C gelagert.
3.7.2 Einbettung und Herstellung von Paraffinschnitten
Die Technik der Paraffineinbettung wurde für die Analyse der apoptotischen RGZ-Zellen nach intravitrealer Injektion von jeweils 3 μl PBS, CTGF, BMP7, CTGF + BMP7, NMDA, NMDA + CTGF, NMDA + BMP7 und NMDA + BMP7 + CTGF verwendet. Die Applikation von NMDA entsprach einer Konzentration von 10 mM.
Für BMP7 und CTGF wurden 30 ng/ml injiziert. Ebenfalls wurden Paraffinschnitte für die Doppelfärbung von pSmad1/5/8 und TUNEL-positiven Zellen nach Glaskörperinjektion, herangezogen.
Die für diese Analyse benötigten Augen wurden 24 h nach intravitrealer Injektion präpariert und für 4 h immersionsfixiert. Anschließend wurden die Augen dreimal 10 min mit 0,1 M Php gespült. Die Einbettung des Gewebes erfolgte im Einbettautomaten, nach Entwässerung mittels aufsteigender Alkoholreihe (Isopropanol (50, 70, 80, 96 und 100 % jeweils 1-2 h)), Xylol (zweimalig 1 h 100 %), in Paraffin (4 h Paraffin, 6 h Paraffin).
Die eingebetteten Augen wurden anschließend auf Holzblöckchen fixiert. Von den Augen wurden mit Hilfe des Supercut-Mikrotoms Schnitte von etwa 5 μm angefertigt.
3.7.3 Epon-Einbettung und Herstellung von semi-Dünnschnitten
Für die Bestimmung der Axonanzahl der Nervi optici nach intravitrealer Injektion (siehe Punkt 3.6.3) mussten die Sehnerven mit EM-Fixans (siehe Tabelle 3-7) für 12 h konserviert und viermal für 2 h mit Cacodylatpuffer gespült werden.
Die Sehnerven wurden in 1 % Osmiumtetroxid nachfixiert, das Osmium wurde mit Cacodylatpuffer ausgewaschen und die Augen in aufsteigender Alkoholreihe (Ethanol 70 %, 80 %, 90 %, 100 %) entwässert. Die Einbettung in Epon erfolgte mit Hilfe eines Einbettautomaten über Azeton nach Standardmethoden: Ethanol/Azeton 1:1; 100 % Azeton; Epon/Azeton 1:2; Epon/Azeton 2:1; 100 % Epon; Aushärten im
Brutschrank 24 h bei 60 °C und 48 h bei 90 °C. Die Lösung für die Eponeinbettung setzte sich dabei aus einer Mischung von Stammlösung A + B im Verhältnis 1:1 (siehe Tabelle 3-7) und einem Beschleuniger DMP-30 (2 %) zusammen. Danach wurden Semidünnschnitte (1 μm) der Nervi optici angefertigt. Vor Analyse der Sehnerven mussten die Querschnitte kontrastiert werden (siehe Punkt 3.7.4.4).
3.7.4 Histochemische Färbungen
Die Darstellung von speziellen Strukturen in Gewebeschnitten oder Zellen erfolgte über die Technik der immunhisto- bzw immunzytochemischen Färbung. Die selektive Markierung der Probe wird durch die Bildung eines indirekten, mehrstufigen Antigen-Antikörper-Komplexes erreicht. Der Primärantikörper bindet an den zu untersuchenden Bestandteil der Zellen, während der Sekundärantikörper gekoppelt mit einem Fluorochrom zur Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie (vgl. Punkt 3.8) dient (Luttmann, 2006).
3.7.4.1 Färbungen von Gefrierschnitten
Für die immunhistochemischen Färbungen musste von den eingebetteten Augen bzw. Sehnerven Semidünnschnitte hergestellt werden. Hierfür wurde ein Microm HM 500 OM Kryostats (Microm International, Walldorf) verwendet. Die Gewebeschnitte wurden daraufhin auf Objektträger aufgenommen, kurz bei RT angetrocknet, und nach folgendem Kurzprotokoll vorgegangen:
Entfernen des Tissue Teks für 1-5 min in 0,1 M Php
Umranden der Gewebeschnitte mit einem Fettstift (PapPen)
Blockierung für 1 h bei RT auf dem Schüttler
Inkubation von 30 μl Primärantikörperlösung (verdünnt in 1:10 Blockierungslösung in 0,1 M Php oder 1 x TBS) ü.N. bei 4 0C
Inkubation von Negativkontrollen nur mit 1:10 Blockierungslösung ü.N. bei 4
0C
Dreimaliges Waschen für 5 min mit dem für die jeweilige Färbung entsprechenden Puffer
Inkubation von 30 μl der fluoreszenzgekoppelten Sekundärantikörperlösung (verdünnt in 1:10 Blockierungslösung in 0,1 M Php oder 1 x TBS) für 1 h bei RT
Dreimaliges Waschen für 5 min mit dem für die jeweilige Färbung entsprechenden Puffer
Eindeckeln der Schnitte mit Fluorescent Mounting Medium + Dapi (1:10)
Bis zur Analyse des Gewebes mit einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop wurden die Schnitte bei 4 °C gelagert. Eine Aufstellung der verwendeten Antiköper und Blockierungslösungen findet sich in Tabelle 3-23.
Protein Blockierungslösung Primärantikörper Sekundärantikörper BDNF 0,2 % CWFG-Puffer
goat-anti-rabbit 1:1000 in
Tabelle 3-23: Übersicht über die verwendeten Anitkörper bei immunhistochemischen Färbungen
3.7.4.2 Färbungen von Paraffinschnitten
Um den Einfluss von CTGF auf den BMP-Signalweg zu untersuchen, wurden zuvor TUNEL-markierte Schnitte zusätzlich mit einem Antikörper gegen pSmad1/5/8 gefärbt. Die Durchführung glich dem unter Punkt 3.7.4.1 beschriebenen Kurzprotokoll. Die Beurteilung erfolgte mit dem Zeiss Fluoreszenzmikroskop über einen Cy3-gekoppelten goat-anti-rabbit Sekundärantikörper (1:2000 Verdünnung 1:1000 in TBS).
3.7.4.3 Färbungen von Zellen
Die wie unter Punkt 3.5.2.1 und 3.5.4.2.2 behandelten und bereits für 5 min mit 4 % PFA fixierten HTM-N- und 661-W-Zellen wurden mit einem spezifischen Antikörper gegen pSmad1/5/8 inkubiert. Die Existenz eines konstitutiv aktiven BMP-Signalwegs im vorderen und hinteren Augenabschnitt sollte hierdurch festgestellt werden.
Die Färbetechnik entsprach dem unter Punkt 3.7.4.1 dargestellten Protokoll, als Sekundärantikörper wurde ein Alexa Fluor®488-gekoppelter Sekundärantikörper (1:1000 verdünnt in TBS) verwendet. Die eingedeckelten und pSmad1/5/8-gefärbten Zellen wurden ebenfalls mit einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
3.7.4.4 Kontrastierung der Nervi optici
Für die Bewertung der Auswirkungen von CTGF und BMP7 unter normalen und krankhaften Bedingungen (vgl. Punkt 3.6.3) auf die Gesamtaxonanzahl der
Sehnerven wurden Nervi optici mit Paraphenylendiamin nach folgendem Protokoll kontrastiert:
Lösen von 500 mg Paraphenylendiamin in 50 ml Ethanol (absolut)
Drei Tage bei Tageslicht inkubieren
Präparate 2-3 min mit dieser Lösung färben
Spülen der Schnitte mit Ethanol
Die kontrastierten Nervi optici wurden mit Hilfe des Zeiss Fluoreszenzmikroskops im Hellfeld aufgenommen und anschließend mit der Software Adobe Photoshop CS3 Extended ausgezählt.