Heterologe Genexpression Verwendete Medien und Lösungen:

SOC-Medium: 20 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 0.5 g NaCl, 0.186 g/l KCl, 2.5 g/l MgSO4.(H2O)7, 3.6 g/l Glucose

Luria-Bertani(LB)-Medium: 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl

LB-Agar: 0.25 % (w/v) Bromphenolblau, 0.25 % (w/v) Xylencyanol, 30 % (v/v) Glycerin

Chemisch-kompetente E. coli Zellen wurden nach Sambrook und Russell [91] hergestellt und für die Transformation verwendet. Dazu wurden 2 µl des rekombinanten Plasmids zu 200 µl der kompetenten Zellen gegeben und der Ansatz für 5 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde ein Hitzeschock für 42 s bei 42 °C durchgeführt und der Ansatz umgehend auf Eis transferiert. Nach 10 min Inkubation wurden die Zellen mit 800 µl SOC- bzw. LB-Medium versetzt und 60 min bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurde die Bakterien-suspension bei 8,000 g für 1 min zentrifugiert, das Zellpellet in einem Volumen von 100 µl resuspendiert und auf LB-Agarplatten ausplattiert. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37 °C.

2.5 Heterologe Genexpression Verwendete Medien und Lösungen:

LB-Medium: 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 1x KPi-Puffer TB-Medium: 12 g/l Trypton, 24 g/l Hefeextrakt, 10 ml/l Glycerin, 1x KPi-Puffer Modifiziertes TB-Medium: 12 g/l Trypton, 24 g/l Hefeextrakt, 10 ml/l Glycerin, 1x KPi-Puffer KPi-Puffer (10x): 122 g/l K2HPO4, 23 g/l KH2PO4

Additive: 0.1 M FeSO4-Lösung

0.1 M Na2S-Lösung 0.1 M NiCl2-Lösung

Zur heterologen Genexpression wurden die entsprechenden Plasmide in E. coli Expressionsstämme transformiert. Vorkulturen wurden entweder durch Transfer einer Einzelkolonie des ausplattierten Transformationsansatzes oder 20 µl der jeweiligen Glycerol-aufbewahrungslösung in LB- oder TB-Medium angeimpft und über Nacht im Schüttel-inkubator bei 37 °C inkubiert.

2.5.1 Expression von cooS-IICh

Das rekombinante Plasmid pPKS2 wurde zunächst in E. coli Rosetta(DE3)-Zellen, welche bereits das pRKISC-Plasmid enthielten, transformiert und eine Vorkultur in mTB-Medium bei 37 °C über Nacht angesetzt. Die Hauptkultur wurde in 800 ml mTB-Medium durch 8 ml Vorkultur angeimpft und zusätzlich mit 0.02 mM NiCl2, 0.1 mM FeSO4, 0.1 mM Na2S und 2 mM L-Cystein kombiniert. Die Kultivierung wurde in 1 l Glasfermentern mit integrierter Begasungseinheit (Ochs Glasgeräte) durchgeführt. Bis zu einer OD600 von 0.7 wurde bei 30 °C unter Begasung mit Luft inkubiert. Die Genexpression erfolgte durch Zugabe von 0.2 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) und das Kulturmedium wurde mit Additivlösungen zu Endkonzentrationen von 0.5 mM NiCl2, 0.5 mM FeSO4, 0.5 mM Na2S und 50 mM KNO3 supplementiert. Zusätzlich wurde die Begasung auf Stickstoff umgestellt, um E. coli ein Wachstum unter anaeroben Bedingungen zu erlauben. Die Zellen wurden 20 h nach Induktion der Genexpression durch Zentrifugation bei 10,700 g pelletiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgte bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C.

2.5.2 Expression von cooS-VCh

Das rekombinante Plasmid pPK-strep-SV wurde in chemisch-kompetente E. coli BL21(DE3)- Zellen transformiert und eine Vorkultur in TB-Medium bei 37 °C über Nacht im Schüttelinkubator gelagert. Die Hauptkultivierung wurde in 5 l TB-Medium durchgeführt, welches zusätzlich mit 1 % (w/v) Glucose, 0.2 mM FeSO4 und 0.2 mM Na2S versetzt wurde.

Durch entsprechende Verdünnung aus der Vorkultur, wurde eine Inokulationszelldichte von 0.05 OD600 hergestellt. Die Kultivierung wurde bei 37 °C unter Rühren und Zugang von Luft bis zu einer OD600 von 0.4 durchgeführt. Daraufhin wurden die Kultivierungsflaschen mit gasdichten Butylgummi-Septen verschlossen und die Genxpression nach Erreichen einer OD600 von 0.8 durch Zugabe von 0.2 mg/l Anhydrotetrazyklin (AHT) induziert. Die Genexpression erfolgte für 16 h bei 30 °C. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 10,700 g und 8 °C für 20 min pelletiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgte bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C.

MATERIAL UND METHODEN

2.6 Proteinreinigung

2.6.1 Reinigung von CODH-IICh

Verwendete Puffer:

Lysis-Puffer (Puffer L) 50 mM Tris (8.0), 20 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 10 % Saccharose, 2 mM Natrium-Dithionit (DT)

Wasch-Puffer (Puffer W) 50 mM Tris (8.0), 20 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 1 mM DTT, 1 mM DT

Elutionspuffer (Puffer E) 50 mM Tris (8.0), 20 mM NaCl, 250 mM Imidazol Lagerungspuffer (Puffer S) 20 mM Tris (8.0), 2 mM DTT, 2 mM DT

CODH-IICh wurde durch immobilisierte Nickel-Affinitätschromatographie mittels N-terminalem His-tag gereinigt. Dazu wurden ca. 8 g Zellen in 50 ml Lysis-Puffer resuspendiert, welcher zusätzlich mit einer Spatelspitze Lysozym (Roth) und DNaseI (AppliChem) versetzt wurde. Nachdem die Suspension für 20 min gerührt wurde, folgte die langsame Zugabe von 10 % (w/v) Deoxycholat (Roth) bis eine finale Konzentration von 0.9 % erreicht wurde. Anschließend wurden die Zellen durch 15-minütige Ultraschallbehandlung mit einem Bandelin Sonopuls (Mikrospitze, 50 % duty cycle, 50 % power) aufgeschlossen und für weitere 20 min unter Rühren inkubiert. Unlösliche Zellbestandteile wurden durch Ultrazentrifugation bei 95,800 g für 60 min bei 12 °C abgetrennt.

Eine 3 ml Ni-Sepharose(SHP)-Säule wurde mit 10 Säulenvolumina Puffer L äquilibriert und der klare Zentrifugationsüberstand durch eine Peristaltikpumpe mit einer Flussrate von 2 ml/min aufgetragen. Anschließend wurde mit 30 ml Puffer W gewaschen und die dunkelbraune CODH-IICh-Lösung in 6 ml Puffer E eluiert. Imidazol wurde durch Pufferaustausch gegen Puffer S auf einer PD-10 Entsalzungssäule entfernt. Das gereinigte Protein wurde mit Vivaspin 500 Konzentratoren (Molekulargewichtsgrenze: 30 kDa, Sartorius) zu einer Konzentration von > 20 mg/ml angereichert, in Glasvials aliquotiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren.

2.6.2 Reinigung von CODH-VCh

Verwendete Puffer:

Lysis-Puffer (Puffer L) 50 mM Tris (8.0), 300 mM NaCl, Spatelspitze Avidin (IBA) Wasch-Puffer (Puffer W) 50 mM Tris (8.0), 300 mM NaCl

Elutionspuffer (Puffer E) 50 mM Tris (8.0), 300 mM NaCl, 2.5 mM Desthiobiotin Lagerungspuffer (Puffer S) 20 mM Tris (8.0)

CODH-VCh wurde mittels N-terminalem Strep-tag durch Streptavidin-Affinitäts-chromatographie gereinigt. Dazu wurden ca. 10 bis 15 g Zellen in 50 ml Puffer L resuspendiert und für 30 min gerührt. Danach erfolgte die Zugabe von pulverförmigem N-Octyl-β-D-Maltosid (AppliChem oder Glycon, Luckenwalde) bis eine Endkonzentration von 0.5 % (w/v) erreicht wurde. Der Zellaufschluss erfolgte durch Ultraschallbehandlung analog zu CODH-IICh. Zelltrümmer und unlösliche Zellbestandteile wurden mittels Ultrazentrifugation bei 95,800 g für 60 min und 12 °C abgetrennt. Der klare Überstand wurde auf eine StrepTactin-SuperFlow-Säule (Säulenvolumen: 10 ml) überführt, die zuvor mit Puffer W äquilibriert wurde. Nach Beendigung des Ladevorgangs wurde mit Puffer W (10 Säulenvolumina) gewaschen und anschließend mit 2 Säulenvolumina Puffer E mit geringer Flussrate eluiert. Rotbraun-gefärbte Fraktionen wurden vereinigt, mittels Zentrifugal-konzentratoren auf ein Volumen von 2 ml eingeengt (MilliPore Amicon-Ultra15, 50 kDa Molekulargewichtsgrenze) und das zur Elution verwendete Desthiobiotin durch eine PD-10 Entsalzungssäule gegen Puffer S abgetrennt. Gereinigte CODH-VCh mit N-terminalem Strep-tag (CODH-VChVL; Volllänge) wurde auf eine Konzentration von >20 mg/ml eingeengt, in Glasvials aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und gelagert.

Zur Abspaltung des Affinitäts-tags wurde TEV-Protease mit N-terminalem Strep-tag (bereitgestellt durch Dr. Martin Bommer) im molaren Verhältnis von 1:100 zur gereinigten CODH-VCh gegeben, auf ein Volumen von 15 ml mit Puffer W verdünnt und im Beisein von 5 mM β-Mercaptoethanol (Merck) über Nacht bei 25 °C inkubiert. Ungeschnittenes Protein und TEV-Protease wurden durch Transfer auf die StrepTactin-SuperFlow-Säule abgeschieden. Tag-befreite CODH-VCh (im weiteren Verlauf als CODH-VChX bezeichnet) befand sich im Durchfluss und wurde gesammelt, konzentriert, in Glasvials aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und gelagert.

MATERIAL UND METHODEN