Herstellung des Zielvektors pR26-Tcaim

Um die genetische Veränderung des R26 Lokus in ES-Zellen zu etablieren, wurde der Tcaim-Leserahmen (Sequenz siehe 7.2) in einen Zielvektor (pR26) kloniert.

5.1.1 KLONIERUNG DES TCAIM-LESERAHMENS IN PDRIVE

Zunächst wurde der Leserahmen von Tcaim amplifiziert (Sequenz siehe 8.1). Die Enden des Fragments wurden durch Sequenzen innerhalb der Primer so verändert, dass sowohl das 5‘-Ende als auch das 3‘-5‘-Ende eine AscI-Schnittstelle aufwies, was die spätere Insertion in den Zielvektor pR26 ermöglichte. Zuerst erfolgte allerdings eine Subklonierung dieses Leserahmens in den Vorvektor pDrive. Als Matrize für die Amplifikation diente ein Vektor, der den Tcaim-Leserahmen enthielt. Die Amplifikation erfolgte und folgenden Bedingungen:

Reaktionsansatz: PCR-Programm:

(GeneAmp PCR System 2400):

Die Überprüfung der Größe des entstehenden Fragments erfolgte durch die Elektrophorese im 1 %igen Agarosegel. Anschließend wurde das Produkt unter Verwendung des PCR Cloning-Kits mit dem Vektor pDrive ligiert.

Reaktionsansatz (Inkubation für 2 h bei 14 °C):

Das Ligationsprodukt wurde mittels Hitzeschock in kompetente E.coli (Stamm: DH5α) transformiert.

5.1.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER B^AKTERIEN

5 ml LB-Medium wurden mit E.coli DH5α angeimpft und über Nacht (ÜN) bei 220 rpm und 37 °C geschüttelt. Am folgenden Tag wurden 100 μl Bakteriensuspension der ÜN-Kultur in 100 ml frisches LB-Medium überimpft und bis zu einer optischen Dichte von OD600 = 0,6 geschüttelt (200 rpm; 37 °C). Die Suspension wurde in zwei Gefäße (50 ml) überführt, für 10 min auf Eis inkubiert und anschließend 10 min bei 4000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 10 ml eiskalter CaCl2-Lösung (0,05-0,1 M)

dNTPs (2.5mM je dNTP) 1,0 µl

dATP 1,0 µl 95 °C 2 min Primer (pROSA_Asc_fw) 1,0 µl 95 °C 40 s

37 Zyklen Primer (pROSA_Asc_rev) 1,0 µl 59 °C 30 s

10-fach Puffer 5,0 µl 72 °C 90 s Polymerase (Easy A) 0,125 µl 72 °C 7 min

H₂O 39,5 µl 4 °C ∞ Matrize 10 ng

pDrive 1,0 µl PCR-Produkt 2,0 µl 2-fach Puffer 5,0 µl DNA 10 ng

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resuspendiert und für 5 min inkubiert. Anschließend wurde die Suspension pelletiert (10 min, 4000 rpm), der Überstand verworfen, das Pellet in 2 ml CaCl2 mit 10 % Glycerol aufgenommen, zu je 100 μl aliquotiert und bei −80 °C weggefroren.

5.1.3 TRANSFORMATION DURCH HITZESCHOCK

0,1-1 µg Ligationsprodukt und 100 µl kompetente Bakterien (E.coli DH5α) wurden vermischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde das Gemisch 30-45 s bei 42 °C inkubiert. Nach dem Hitzeschock wurde 1 ml vorgewärmtes LB Medium (ohne Antibiotika) zugegeben und für eine Stunde geschüttelt. Die Bakteriensuspension wurde in verschiedenen Konzentrationen auf ampicillinhaltige Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

5.1.4 K^OLONIE-PCR

Bakterienkolonien wurden gepickt und in LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin geschüttelt (6-9 h; 200 rpm; 37 °C). Ob die Bakterien das Fragment trugen, wurde mittels Kolonie-PCR überprüft:

Reaktionsansatz: PCR-Programm:

(GeneAmp PCR System 2400)

Konnte das Tcaim-AscI Fragment detektiert werden (etwa 1500 bp), wurden die angeimpften Kulturen ÜN bei 37 °C geschüttelt und die DNA durch eine Plasmidaufreinigung mittels JETSTAR 2.0 Plasmid Mini Kit im kleinen Maßstab isoliert. Anschließend wurde die DNA durch die Firma MWG Eurofins Operon sequenziert, bei korrekten Sequenzierungsergebnissen im großen Maßstab vermehrt und mittels JETSTAR 2.0 Plasmid Maxi Kit aufgereinigt. Der Einbau des Leserahmens wurde nach der Aufreinigung stets durch einen Restriktionsverdau überprüft. Der entstandene Vorvektor wurde pDrive-Tcaim-Asc genannt.

5.1.5 KLONIERUNG DES T^CAIM-LESERAHMENS IN PR26

Der Vektor pR26 wurde durch Dr. Wunderlich (Universität Köln, Institut für Genetik) bereitgestellt. Abbildung 5-1 zeigt eine Vektorkarte des naiven Zielvektors und die Klonierungsstelle für den Tcaim-Leserahmen (LR). Der Vektor enthielt die folgenden genetischen Elemente:

• Ausgedehnte homologe Sequenzen zum R26 Lokus (R26 HS) ermöglichten eine homologe Rekombination.

dNTPs (2.5mM je dNTP) 1,0 µl

Primer (pROSA_Asc_fw) 1,0 µl 95 °C 2 min Primer (pROSA_Asc_rev) 1,0 µl 95 °C 40 s

37 Zyklen 10-fach Puffer 2,5 µl 59 °C 30 s

Polymerase 0,1 µl 72 °C 90 s Bakteriensuspension 2,0 µl 72 °C 7 min

H₂O ad 25 µl 4 °C ∞

5 Methoden

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• Resistenzgene für Ampicillin (Amp^r) und Geneticin/Neomycin (Neo^r) erlaubte eine Selektion der transformierten Bakterien oder Stammzellen.

• Eine Sequenz zur transkriptionellen Terminierung (STOP) verhinderte die Transkrip-tion von Tcaim. Sie besteht aus drei aufeinanderfolgenden Polyadenylierungs-sequenzen.

• loxP-Stellen flankieren die Neo^r-STOP-Kassette.

• Eine AscI Restriktionsstelle ermöglichte die Insertion des Tcaim-Leserahmens (LR).

• Der Insertionsstelle folgen eine interne ribosomale Einstrittsstelle (IRES) und ein Leserahmen für Egfp (enhanced green fluorescent protein). Dies gestattete eine koordinierte Expression von Tcaim und Egfp durch eine gemeinsame mRNA.

• FRT-Stellen flankieren die IRES-Egfp Sequenz und erlauben eine Flippase-vermittelte Rekombination, was zu einer Exzision von IRES-Egfp führen würde.

• Die Expression des Transgens und Egfp wurde durch den CAG-Promoter (chicken/actin/globulin) initiiert.

• Die AsiSI-Restriktionsstelle ermöglichte die Linearisierung des Vektors vor der Elektroporation.

Abbildung 5- 1. Vektorkarte von pR26. Der Vektor enthielt die folgenden genetischen Elemente: ausgedehnte zum R26 Lokus homologe Bereiche (R26 HS), Resistenzgene für Ampicillin (Amp^r) und Geneticin (Neo^r), einen Promoter (CAG), einen transkriptionellen Terminator (STOP), eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), einen Leserahmen für Egfp, loxP- und FRT-Sequenzen sowie Restriktionsstellen für die Enzyme AsiSI und AscI.

Dargestellt ist die Insertionsstelle für den Tcaim-Leserahmen.

Die Vektor-DNA wurde durch die Transformation in E.coli XL Gold gemäß Herstellerangaben vermehrt und durch die DNA durch eine Plasmidaufreinigung im großen Maßstab mittels Large Construct Kit gemäß Herstellerangaben isoliert.

Der Vorvektor pDrive-Tcaim wurde mit dem Restriktionsenzym AscI verdaut. Ebenso wurde der Zielvektor mit dem Restriktionsenzym AscI verdaut, danach gefällt (Protokoll siehe 5.1.5) und wie folgt dephosphoryliert:

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CIP-Vormix: Reaktionsansatz

Sowohl Zielvektor als auch Tcaim-PCR-Fragment wurden anschließend auf ein Agarosegel aufgetragen und mittels Gelextraktion aufgereinigt (gemäß Herstellerangaben mittels JETQUICK Gel Extraction Spin Kit). Die isolierte DNA wurde ein weiteres Mal gefällt und anschließend nach folgendem Protokoll ligiert.

Reaktionsansatz:

Die Vektor- und Insert-DNA sollte in etwa äquimolaren Mengen in den Ligationsansatz gegeben werden. Ligiert wurde für 2 h bei 17 °C und anschließend bei 65 °C 10 min inaktiviert. Das Ligationsprodukt wurde gemäß Herstellerangaben in kompetente E.coli XL Gold transformiert und Zellklone wie bereits beschrieben ausplattiert und mittels Kolonie-PCR überprüft. Positive Klone wurden vermehrt, deren Plasmid-DNA mittels Large Construct Kit isoliert und aufgereinigt. Die DNA wurde durch die Firma Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) sequenziert und durch einen AsiSI-Verdau linearisiert.

5.1.6 DNA-FÄLLUNG

Die gelöste DNA wurde mit H2O auf 200 µl aufgefüllt. 20 µl 3 M Natriumacetat (¹/10 des Volumens und 550 µl 100 %iges Ethanol (2,5-faches Volumen) wurde zugegeben und gemischt. Die Fällung wurde ÜN bei −80 °C inkubiert und anschließend 90 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Präzipitat mit 200 µl 100 %igem Ethanol gewaschen (15 min; 13000 rpm). Anschließend wurde der Überstand abgenommen. Sobald das Präzipitat getrocknet war, konnte es wieder in Wasser gelöst werden.