Herstellung der T-DNA-Histonfusionskonstrukte

Anhang | 127

Konstrukt P^H3.1::H3.1-V5/His

Unter der Verwendung der Pfu-Polymerase konnte kein PCR-Produkt mit den genspezifischen Primern At5g65360PromKpnfor und At5g65360PromAparev an genomischer DNA erhalten werden. Deswegen erfolgte die Amplifikation von At5g65360, inklusive einer 999 bp langen Sequenz stromaufwärts des Start-ATGs, mit der iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad). Anschließend fand eine Restriktion an den endständig eingefügten Schnittstellen für die Restriktionsenzyme KpnI und ApaI und die Klonierung in den Vektor pAc5.1-V5/His statt. Durch die Restriktion mit KpnI und Mva1269I (=BsmI) unter Zugabe von Klenow-Fragment und dNTPs erfolgte der Ausbau der PH3.1 ::V5/His-PolyA-Kassette aus dem pAc-Vektor und die Herstellung von glatten Fragment-Enden. Diese Kassette wurde über SmaI ungerichtet in die Multiklonierungsstelle 2 des Transformationsvektors pCB302 kloniert. Mit der Primerkombination RightBorderpCB302for und At5g65360PromKpnfor wurden Vektoren mit der Klonierungskassette PH3.1 ::H3.1-V5/His-PolyA in gleicher Orientierung zum BAR-Gen selektiert.

Konstrukt PH3.3::H3.3-V5/His

Die H3.3-Gensequenz, inklusive einer 864 bp langen Sequenz stromaufwärts des Start-ATGs, wurde mit genspezifischen Primern At4g40040PromXhofor und At4g40040PromAparev unter Verwendung der Pfu-Polymerase an genomischer DNA amplifiziert, an den endständig eingefügten Restriktionsschnittstellen für XhoI und ApaI verdaut und in pAc5.1-V5/His kloniert. Zur Klonierung in pCB302 wurde die PH3.3::H3.3-V5/His-PolyA-Kassette über EcoRI und HpaI aus dem pAc-Vektor ausgeschnitten. Die Ligation erfolgte in pCB302 über die Schnittstellen für EcoRI und SmaI. Zur Transformation in Agrobakterium wurde mit der Primerkombination RightBorderpCB302for und At4g40040PromXhofor Klonierungsvektoren mit PH3.3::H3.3-V5/His in gleicher Orientierung zum BAR-Gen selektiert.

Konstrukt P^H4::H4-V5/His

Die Amplifikation der Gensequenz für At1g07820, inklusive einer 494 bp langen Sequenz stromaufwärts des Start-ATGs, erfolgte ebenfalls mit den genspezifischen Primern At1g07820PromEcofor und At1g07820PromXbarev sowie der Pfu-Polymerase an genomischer DNA. Anschließend erfolgte die Restriktion an den enständig eingefügten Schnittstellen für die Restriktionsenzyme EcoRI und XbaI und die Klonierung in

pAc5.1-V5/His. Über die Restriktion mit EcoRI und MunI (=MfeI) wurde die PH4 ::H4-V5/His-PolyA-Kassette ausgeschnitten. Die Zugabe von Klenow-Fragment ermöglichte die Herstellung von glatten Enden. Über die SmaI-Restriktionsschnittstellen erfolgte zuletzt die Klonierung in die Multiklonierungsstelle 2 des Transformationsvektor pCB302. Mit der Primerkombination rightborderpCB302for und At1g07820PromEcofor wurden Klonierungsvektoren mit PH3.1::H3.1-V5/His in gleicher Orientierung zum BAR-Gen selektiert.

Abb. 7.6: Graphische Darstellung der verwendeten Vektoren. (A) Der Vektor pAc5.1/V5-His A mit dem Selektionsmarker Ampicillin und der multiplen Klonsierungsstelle zur Klonierung des C-terminalen V5-His-Tags.

(B) pRT100 bzw. pRT101 mit der Expressionskassette mit CaMV-35S-Promotor (P35S), der jeweiligen multiplen Klonierungsstelle, der Poly-A-Sequenz und dem Selektionsmarker Ampicillin. (C) Dargestellt ist die pCB302-T-DNA mit linker Border (LB), rechter Border (RB), die beiden multiplen Klonierungsstellen 1 und 2 (MCS 1 und 2) sowie des BASTA^®-Resistenzgen BAR mit Promotor (Pnos) und Terminationssignal (Tnos). Der Vektor pCB302 verfügt zusätzlich noch über ein Kanamycin-Resistenzgen (nptII) als Selektionsmarker (nicht in der Abbildung dargestellt).

BamH I Sma I Kpn I Sst I Nco I Apa I Xho I HindIII SphI Pst I HindIII SphI Pst I HincI

HindIII ClaI Sal I XhoI ApaI KpnI SstI SstII Not I BstXI XbaI Spe I BamHI SmaI Pst I EcoRI

KpnI BstXI EcoRV BstXI Not I XhoI XbaI ApaI BstBI Age I

V5 6xHis Poly-A

BamH I Sma I Kpn I Sst I

Xho I Eco RI

pRT100 pRT101

A B

C

5.4 kb

A

BAR

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Publikationsliste

Naumann K, Fischer A, Hofmann I, Krauss V, Phalke S, Irmler K, Hause G, Aurich AC, Dorn R, Jenuwein T, Reuter G (2005) Pivotal role of AtSUVH2 in heterochromatic histone methylation and gene silencing in Arabidopsis. EMBO J. 24(7): 1418-29.

Ay N, Irmler K, Fischer A, Uhlemann R, Reuter G, Humbeck K (2009) Epigenetic

programming via histone methylation at WRKY53 controls leaf senescence in Arabidopsis thaliana. Plant J. 58(2): 333-46.

Danksagung

Mein ausdrücklicher Dank gilt Prof. Dr. Gunter Reuter für die Überlassung des vielfältigen Themas sowie für die ständige Diskussionsbereitschaft, Betreuung und die umfangreichen Ideen und Vorschläge.

Ein großer Dank geht außerdem an den SFB648 für die finanzielle Unterstützung.

Mein besonderer Dank gilt Dr. Andreas Fischer und Dr. Ingo Hofmann für die umfangreiche und freundschaftliche Zusammenarbeit im Labor, für die experimentellen Einweisungen, für die zahlreichen Ideen, Diskussionen, Ratschläge und Unterstützungen jeglicher Art. Besonders danke ich Ingo für die Verfügungsstellung von Samen und Pflanzenmaterial und für die Unterstützung bei der Anzucht sowie Andreas für die Hilfestellungen bei der Durchführung von immunozytologischen Analysen und mikroskopischen Untersuchungen sowie der Verwirklichung der Histonfusionskonstrukte und der Durchsicht dieses Manuskriptes.

Dr. Dmitri Demidov und Dr. A. Houben danke ich für die Kooperation und der Verfügungstellung der synthetischen Histonsequenz und besonders Dmitri für die Kooperation zur Aufreinigung und Isolation der Fusionsproteine.

Prof. Vincent Colot und Francois Roudier danke ich für die Möglichkeit des Forschungsaufenthaltes in Evry und der Erlernung der ChIP- und ChIP-on-Chip-Techniken.

Nicole Ay danke ich für unsere freundschaftliche und produktive Zusammenarbeit im Seneszenzprojekt und auch darüber hinaus, für die Einweisung in die Real-Time-PCR, für viele Tipps, Ratschläge und offene Ohren.

Der gesamten AG Humbeck danke ich außerdem für die Möglichkeit zur Benutzung des Real-Time-PCR Gerätes.

Ein Dank geht auch an die Studenten, die im Rahmen von Diplomarbeiten, Bachelorarbeiten, Masterarbeiten, hilfswissenschaftlichen Tätigkeiten oder Praktikas zur Identifizierung und näheren Charakterisierung der Silencing-Suppressormutanten beigetragen haben und mir damit Arbeitsmaterial verschafft haben.

Katrin Kittlaus danke ich für die Sequenzanalysen und für die Zuarbeiten sowie Ramona Abe für die Bereitstellung von sauberen Reagenzgefäßen.

Bei der gesamten Arbeitsgruppe Entwicklungsgenetik, besonders aber Andreas Fischer, Ingo Hofmann, Wiebke Kummer, Sandy Mietzsch, Kathleen Heidrich, Claudia Nickel, Sandro Lein, Olaf Nickel, Stefanie Beuch und Mathias Walther danke ich für die herzliche, freundschaftliche und humorvolle Arbeitsatmosphäre, für den experimentellen Gedankenaustausch und die Hilfestellungen sowie für die zahlreichen Unternehmungen auch außerhalb des Laboralltages.

Der größte Dank gilt jedoch meiner geliebten Familie, die mich auf meinem Weg in vielfältiger Weise unterstützt hat. Ich danke euch für die bedingunslose Liebe und dass ihr in der schweren Zeit für mich da ward.

Alexander danke ich für seine Engelsgeduld, für die Fürsorge und Hilfe in meiner schweren Zeit und für seine Liebe darüber hinaus.

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Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit „Die Analyse von heterochromatischem Gen-Silencing in Arabidopsis thaliana‘‘ selbständig und nur unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel und Quellen angefertigt habe. Die den genutzten Werken wörtlich bzw. inhaltlich entnommenen Stellen wurden als solche gekennzeichnet.

Diese Arbeit wurde von mir an keiner anderen wissenschaftlichen Institution vorgelegt.

Halle/Saale, den 27.10.2014

Kristina Irmler