Das RGS16-Promotordeletionskonstrukt 1,4 kb-Sac I (Lage, Abbildung 11) wurde durch Restriktionsverdau des pGL3b-RGS16-Promotorkonstruktes 1,8 kb-Kpn I mit Sac I hergestellt. Abbildung 14 A zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente nach dem Restriktionsverdau mit Sac I in einem 1 % igen Agarosegel. Neben der Vektor-DNA-Bande wurden zwei weitere Banden bei 1,4 kb und 388 bp detektiert. Die 1,4 kb lange Bande und die Vektor-DNA-Bande wurden durch Gelelution aus dem Agarosegel gewonnen. Der mit Sac I geöffnete Vektor wurde zur Verhinderung seiner Re-Ligation dephosphoryliert. Das 1,4 kb lange DNA-Fragment wurde anschließend wieder mit dem pGL3b Vektor ligiert.
Zur Kontrolle des Ligationserfolges und der Orientierung des Deletions- konstruktes 1,4 kb-Sac I im pGL3b Vektor wurde sowohl eine Sequenzierung mit den
vektor-spezifischen Primern: RVprimer3 / GLprimer2 und genvektor-spezifischen Primern (siehe Material und Methoden, 2.1.4) als auch eine Restriktion mit EcoR I (Lage der Restriktionsstellen, siehe Abbildung 11) durchgeführt. Bei richtiger Orientierung des Deletionskonstruktes 1,4 kb-Sac I sollte nach der Restriktion mit EcoR I neben der Vektor-DNA-Bande eine Bande bei 718 bp im Agarosegel detektiert werden können. Falsche Orientierung sollte neben der Vektor-DNA-Bande eine Vektor-DNA-Bande bei 632 bp im Agarosegel zeigen. Sequenzierung und die in Ab- bildung 14 B gezeigte Auftrennung der einzelnen DNA-Fragmente in einem 1,5 % igen Agarosegel nach der Restriktion des im pGL3b Reportervektor befindlichen Deletionskonstruktes 1,4 kb-Sac I mit EcoR I zeigten die richtige Orientierung dieses Konstruktes im pGL3b Vektor. Das Konstrukt wurde für weitere Experimente eingesetzt.
- 97 -
A B
Abbildung 14: Herstellung und Kontrollverdau des RGS16-Promotor-deletionskonstruktes 1,4 kb-Sac I
Abbildung 14 A zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente des pGL3b-RGS16-Promotor- konstruktes 1,8 kb-Kpn I in einem 1 % igen Agarosegel nach Restriktionsverdau mit Sac I. Neben der
Vektor-DNA-Bande können zwei weitere Banden bei 1,4 kb und 388 bp detektiert werden. Die Vektor-Vektor-DNA-Bande und die 1,4 kb lange Bande wurden durch Gelelution aus dem Agarosegel gewonnen. Das 1,4 kb lange Fragment wurde in den pGL3b Vektor religiert. Abbildung 14 B zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente des im pGL3b Vektor befindlichen RGS16-Promotordeletionskonstruktes 1,4 kb-Sac I in einem 1,5 % igen Agarosegel nach Restriktionsverdau mit EcoR I. Bei richtiger Orientierung des Deletionskonstruktes im Vektor kann, wie oben gezeigt, neben der Vektor-DNA-Bande eine Bande bei 718 bp im Agarosegel detektiert werden. Als Längenstandard 1 diente der 1 kb DNA Ladder (Biolabs), Längenstandard 2 ist der 100 bp DNA Ladder (Biolabs).
Das RGS16-Promotordeletionskonstrukt 1,0 kb-EcoR I (Lage, Abbildung 11) wurde durch Restriktionsverdau des pGL3b-RGS16-Promotorkonstruktes 1,8 kb-Kpn I mit EcoR I (Lage der Restriktionsstellen, siehe Abbildung 11) hergestellt. Abbildung 15 A zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente nach dem Restriktionsverdau mit EcoR I in einem 1 % igen Agarosegel. Im Agarosegel konnten zwei Banden, eine Bande bei ∼6 kb (Vektor mit gewünschten Insert) und eine Bande bei 718 bp detektiert werden. Die ∼6 kb lange Bande wurde durch Gelelution aus dem Agarosegel gewonnen und anschließend wieder religiert.
- 98 - 2,0 kb 1,5 kb 1,2 kb 1,0 kb
0,5 kb 0,4 kb
2,0 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,8 kb 0,7 kb 0,5 kb Restriktion Längen- Längen-
des RGS16- standard 2 standard 1 Promotorkon.
1,8 kb-Kpn I mit Sac I
Längen- Längen- Restriktion standard 1 standard 2 des RGS16- Promotorkon.
1,4 kb-Sac I
mit EcoR I Vektor
1,4 kb kloniertes Fragment
388 bp
Vektor
718 bp
Zur Kontrolle wurde eine Restriktion mit Kpn I durchgeführt, bei der das gesamte Insert, 1021 bp, aus dem pGL3b Vektor herausgeschnitten wird. In Abbildung 15 B wird die Auftrennung der einzelnen DNA-Fragmente in einem 1,5 % igen Agarosegel nach der Restriktion des im pGL3b Reportervektor befindlichen RGS16-Promotordeletions- konstruktes 1,0 kb-EcoR I mit Kpn I gezeigt. Neben der Vektor-DNA-Bande wurde eine 1021 bp lange Bande im Agarosegel detektiert. Dieses Konstrukt wurde für weitere Experimente eingesetzt.
A B
Abbildung 15: Herstellung und Kontrollverdau des RGS16-Promotor-deletionskonstruktes 1,0 kb-EcoR I
Abbildung 15 A zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente des pGL3b-RGS16-Promotor- konstruktes 1,8 kb-Kpn I in einem 1 % igen Agarosegel nach Restriktionsverdau mit EcoR I. Neben einer Bande
bei ∼6 kb (Vektor mit gewünschten Insert) kann eine weitere Bande bei 718 bp detektiert werden. Die ∼6 kb lange Bande wurde durch Gelelution aus dem Agarosegel gewonnen und anschließend wieder religiert.
Abbildung 15 B zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente des im pGL3b Vektor befindlichen RGS16-Promotordeletionskonstruktes 1,0 kb-EcoR I in einem 1,5 % igen Agarosegel nach Restriktionsverdau mit Kpn I. Durch Restriktion mit Kpn I wurde das gesamte Deletionskonstrukt 1,0 kb-EcoR I (1021 bp) aus dem Vektor herausgeschnitten. Als Längenstandard 1 diente der 1 kb DNA Ladder (Biolabs), Längenstandard 2 ist der 100 bp DNA Ladder (Biolabs).
- 99 - Vektor + gewünschtes Insert 6,0 kb
3,0 kb 2,0 kb 1,5 kb 1,2 kb 1,0 kb 0,8 kb 0,7 kb 0,5 kb
Vektor
1021 bp (Insert)
1,5 kb 1,2 kb 1,0 kb
0,5 kb Längen- Längen- Restriktion
standard 1 standard 2 des RGS16- Promotorkon.
1,8 kb-Kpn I mit EcoR I
Restriktion Längen- Längen- des RGS16- standard 2 standard 1 Promotorkon.
1,0 kb-EcoR I mit Kpn I 718 bp
Das RGS16-Promotordeletionskonstrukt 0,6 kb-EcoR I-Sac I (Lage, Abbildung 11) wurde durch Restriktionsverdau des im pGL3b Vektor befindlichen RGS16-Promotordeletionskonstruktes 1,4 kb-Sac I mit EcoR I (Lage der Restriktionsstellen Abbildung 11) hergestellt. Abbildung 16 A zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente nach dem Restriktionsverdau mit EcoR I in einem 1 % igen Agarosegel. Im Agarosegel konnten zwei Banden, eine Bande bei ∼5,4 kb (Vektor mit gewünschten Insert) und eine Bande bei 718 bp detektiert werden. Die ∼5,4 kb lange Bande wurde durch Gelelution aus dem Agarosegel gewonnen und anschließend wieder religiert.
Zur Kontrolle wurde eine Restriktion mit Sac I durchgeführt, bei der das gesamte Insert, 633 bp, aus dem pGL3b Vektor herausgeschnitten wird. In Abbildung 16 B wird die Auftrennung der einzelnen DNA-Fragmente in einem 1,5 % igen Agarosegel nach der Restriktion des im pGL3b Reportervektor befindlichen RGS16-Promotordeletions- konstruktes 0,6 kb-EcoR I-Sac I mit Sac I gezeigt. Neben der Vektor-DNA-Bande wurde eine 633 bp lange Bande im Agarosegel detektiert. Dieses Konstrukt wurde für weitere Experimente eingesetzt.
A B
Abbildung 16: Herstellung und Kontrollverdau des RGS16-Promotor-deletionskonstruktes 0,6 kb-EcoR I-Sac I
Abbildung 16 A zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente des im pGL3b Vektor befindlichen RGS16-Promotordeletionskonstruktes 1,4 kb-Sac I in einem 1 % igen Agarosegel nach Restriktionsverdau mit EcoR I.
Neben einer Bande bei ∼5,4 kb (Vektor mit gewünschten Insert) kann eine weitere Bande bei 718 bp detektiert werden. Die ∼5,4 kb lange Bande wurde durch Gelelution aus dem Agarosegel gewonnen und anschließend wieder religiert. Abbildung 16 B zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente des im pGL3b Vektor befindlichen RGS16-Promotordeletionskonstruktes 0,6 kb-EcoR I-Sac I in einem 1,5 % igen Agarosegel nach Restriktionsverdau mit Sac I. Durch Restriktion mit Sac I wurde das gesamte RGS16-Promotordeletions-konstrukt 0,6 kb-EcoR I-Sac I (633 bp) aus dem Vektor herausgeschnitten. Als Längenstandard 1 diente der 1 kb DNA Ladder (Biolabs), Längenstandard 2 ist der 100 bp DNA Ladder (Biolabs).
- 101 - 5,0 kb
4,0 kb 3,0 kb 2,0 kb 1,5 kb 1,2 kb 1,0 kb 0,5 kb
Vektor + gewünschtes Insert
2,0 kb 1,5 kb 1,2 kb 1,0 kb 0,7 kb 0,5 kb
Vektor
Längen- Längen- Restriktion standard 1 standard 2 des RGS16- Promotorkon.
1,4 kb-Sac I mit EcoR I
Längen- Längen- Restriktion standard 1 standard 2 des RGS16- Promotorkon.
0,6 kb-EcoRI- SacI mit Sac I
718 bp 633 bp
Das RGS16-Promotordeletionskonstrukt 0,4 kb-Sac I (liegt an der Sac I-Restriktionssstelle im Insert bis Sequenzende, Lage, Abbildung 11) wurde durch PCR mit den genspezifischen Primern, 5´ Primer: GTA GCA ATC TCG AAG GGA G und dem 3´ Primer: CAT GGT CTT CGA AGG TGA C, hergestellt. Als Template für die PCR-Reaktion diente das RGS16-Promotorkonstrukt 1,8 kb-Kpn I (Abbildung 11). Die Amplifikation wurde in einem Agarosegel überprüft. Abbildung 17 A zeigt die Überprüfung des Amplifikationserfolges in einem 1,5 % igen Agarosegel. Das PCR-Produkt wies eine Länge von ca. 0,4 kb auf. Es wurde in den pCRR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) kloniert (Abbildung 12 A) und in E. coli Bakterien vermehrt (Klonierungsstragie, Abbildung 13). Sequenzüberprüfung mit den Vektor-Primern: M13 Reverse / M13 Forward und genspezifischen Primern (siehe Material und Methoden, 2.1.4) zeigte eine Länge des PCR-Produktes von 394 bp und eine „falsche“
Orientierung des Inserts im Vektor. Gezielte Wahl der Restriktionsenzyme zum Herausschneiden des RGS16-Promotordeletionskonstruktes 0,4 kb-Sac I aus dem pCRR 2.1-TOPO Vektor und für die Umklonierung in den pGL3b Vektor erlaubt eine „gerichtete“
Klonierung in den pGL3b Reportervektor. Auf Grund der „falschen“ Orientierung des RGS16-Promotordeletionskonstruktes 0,4 kb-Sac I im pCRR2.1-TOPO Vektor wurden die Restriktionsenzyme Hind III und Xho I zum Herausschneiden des Konstruktes aus dem PCR-Vektor und die anschließende gerichtete Klonierung in den pGL3b Reportervektor gewählt (Klonierungsvektoren, Abbildung 12). Dies sollte zur richtigen Orientierung des Konstruktes im pGL3b Reportervektor führen. Der pGL3b Reportervektor wurde ebenfalls mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xho I geöffnet.
Abbildung 17 B zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente nach dem Restriktionsverdau des im pCRR2.1-TOPO Vektor befindlichen RGS16-Promotordeletionskonstruktes 0,4 kb-Sac I mit Hind III und Xho I in einem 1,5 % igen Agarosegel. Neben der Vektor-DNA-Bande konnte eine Bande bei 0,5 kb im Agarosegel detektiert werden, dabei handelt es sich um das RGS16-Promotordeletionskonstrukt 0,4 kb-Sac I. Die Bande ist länger als das gewünschte Insert, da Nukleotide aus der Multiple Cloning Site des pCRR2.1-TOPO Vektor enthalten sind. Die 0,5 kb lange Bande wurde durch Gelelution aus Agarosegel gewonnen und über Hind III und Xho I Restriktionsstellen in den ebenfalls mit Hind III und Xho I geöffneten pGL3b Reportervektor ligiert. Die richtige Orientierung des im pGL3b Vektor befindlichen RGS16-Promotordeletionskonstruktes 0,4 kb-Sac I wurde durch Sequenzierung mit den vektorspezifischen Primern: RVprimer3 / GLprimer2 und genspezifischen Primern (siehe Material und Methoden, 2.1.4) überprüft.
- 102 -
Das Konstrukt wies die gewünschte Orientierung im pGL3b Vektor auf. Es wurde für weitere Experimente ausgewählt.
A B
Abbildung 17: Herstellung und Kontrollverdau des RGS16-Promotordeletions- konstruktes 0,4 kb-Sac I
Abbildung 17 A zeigt das RGS16-Promotordeletionskonstrukt 0,4 kb-Sac I (liegt an der Sac I-Restriktionsstelle im Insert bis Sequenzende, Lage, Abbildung 11) in einem 1,5 % igen Agarosegel. Es wurde durch PCR mit den genspezifischen Primern, 5´-Primer: GTA GCA ATC TCG AAG GGA G und dem 3´-Primer: CAT GGT CTT CGA AGG TGA C, hergestellt. Als Template für die PCR-Reaktion diente das RGS16-Promotor- konstrukt 1,8 kb-Kpn I. Das PCR-Produkt wurde in den pCRR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) kloniert (Abbildung 12 A). Um eine gerichtete Klonierung in den pGL3b Reportervektor zu ermöglichen, wurde das PCR-Produkt mit den Restriktionsenzymen, Hind III und Xho I, aus dem pCRR2.1-TOPO Vektor herausgeschnitten. Abbildung 17 B zeigt die Auftrennung der DNA-Fragmente in einem 1,5 % igen Agarosegel nach Restriktionsverdau des im pCRR2.1-TOPO Vektor befindlichen RGS16-Promotordeletionskonstruktes 0,4 kb-Sac I mit Hind III und Xho I. Neben der Vektor-DNA-Bande wurde eine Bande bei 0,5 kb im Agarosegel detektiert, dabei handelt es sich um das RGS16-Promotordeletionskonstrukt 0,4 kb-Sac I. Die Bande ist länger als das gewünschte Insert, da Nukleotide aus der Multiple Cloning Site des pCRR2.1-TOPO Vektor enthalten sind. Die 0,5 kb lange Bande wurde durch Gelelution aus Agarosegel gewonnen und über Hind III und Xho I Restriktionsstellen in den ebenfalls mit Hind III und Xho I geöffneten pGL3b Reportervektor ligiert. Als Längenstandard 1 diente der 1 kb DNA Ladder (Biolabs), Längenstandard 2 ist der 100 bp DNA Ladder (Biolabs).
- 103 - 2,0 kb
1,5 kb 1,2 kb 1,0 kb
0,5 kb 0,4 kb
Längen- Längen- RGS16- standard 1 standard 2 Promotor-
konstrukt 0,4 kb-Sac I
2,0 kb 1,5 kb 1,2 kb 1,0 kb
0,5 kb 0,4 kb
Vektor
0,5 kb (Insert) Längen- Längen- Restriktion
standard 1 standard 2 des RGS16- Promotorkon.
0,4 kb-Sac I mit Hind III und Xho I