Hefe-1-Hybrid System

2.11.1. Transformation von Hefezellen

Der Hefestamm Y1H-aS2 wurde einerseits zur Herstellung von stabilen Köderstämmen transformiert und zum anderen zur transienten Expression von AD-Beuteplasmiden in diesen Köderstämmen. Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Schritte bei RT durchgeführt.

Die Herstellung chemisch kompetenter Hefezellen erfolgte am Tag der Transformation. Dazu wurde zunächst eine Kolonie mit einer sterilen Impföse auf eine frische Platte mit 25 ml YAPD Medium (20 g Pepton; 10 g Hefeextrakt; 0,16 g Adeninhemisulfat-dihydrat; 17,5 g Agar; 2 % [w/v] Glucose; H2O zu 1000 ml) übertragen und ÜN bei 30 °C inkubiert. Das finale Volumen Q, welches sich aus der Anzahl der geplanten Transformationsansätze n und dem Einzelvolumen e eines Transformationsansatzes ergab, wurde berechnet. Für die Integration von linearisierten Ködervektoren betrug e = 200 µl und bei der transienten Transformation von 40 ng Beuteplasmid betrug e = 30 µl. Der frische Hefestamm wurde in einem Volumen von 200Q flüssigem YAPD Medium (20 g Pepton; 10 g Hefeextrakt; 0,16 g Adeninhemisulfat-dihydrat; 2 % [w/v] Glucose; H2O zu 1000 ml) zu einer OD600 von 0,15-0,2 resuspendiert. Die Starterkultur wurde für etwa 5 h bei 30 °C und 200 rpm bis zu einer OD600 von 0,4-0,6 inkubiert und schließlich bei 700 g für 5 min zentrifugiert (Ausschwingrotor, RT). Die Zellen

38 wurden in 20Q H2O resuspendiert, erneut zentrifugiert und in 4Q einer frischen TE/LiAc Lösung (5 ml 10 x TE-Puffer (100mM Tris, 10 mM EDTA; pH 8.0); 5 ml Lithiumacetat (1M);

H2O zu 50 ml) resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in einem Volumen von 1Q der TE/LiAc Lösung aufgenommen. Zur Suspension wurden Q/10 einzelsträngige Lachssperma DNA (10 mg/ ml) gemischt. Das Hefe/TE/LiAC/ssDNA - Gemisch wurde zu Aliquots mit je 1e aufgeteilt und mit der zu transformierenden Plasmid-DNA versetzt. Zu diesem Ansatz wurde ein Volumen von 5(e+Plasmid) einer frisch hergestellten TE/LiAc/PEG Lösung (5 ml TE (10 x pH 8,0); 5 ml Lithiumacetat (1M); 40 % [w/v] PEG3350; H2O zu 50 ml) gegeben und gründlich vermischt. Der Transformationsansatz wurde für 30 min – 4h bei 30 °C inkubiert und schließlich für 20 min bei 42 °C hitzegeschockt. Zellen wurden sofort pelletiert (1 min, RT, 700 g) und in H2O resuspendiert.

Das finale Volumen zur Herstellung von stabilen Köderstämmen betrug 700 µl, jenes für die transiente Transformation von Beuteplasmiden zum Protein-DNA Interaktionsnachweis betrug 20 µl.

2.11.2. Herstellung von stabilen Köderstämmen

Zur Herstellung von Köderplasmiden wurden einzelsträngige Oligonukleotide nach Annealing in den Entryvektor pMW#5 ligiert und schließlich mittels LR-Reaktion in die Reportervektoren pMW#2 und pMW#3 eingebracht (siehe 2.2.11, 2.2.12 und 2.3.3). Für die Integration der Vektoren in den Hefestamm Y1H-aS2 wurden zunächst separate Restriktionsreaktionen angesetzt. Für pMW#2-Konstrukte wurden 2 µg des Ködervektors, 2,5 µl Bovines Serum Albumin (BSA; 1 mg / ml), 2,5 µl des 10 x Restriktionspuffers R (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), 20 U XhoI (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA); und H2O zu 25 µl verwendet. Bei Vektoren mit pMW#3-Rückgrat wurden 2 µg des Ködervektors, 2,5 µl Bovines Serum Albumin (BSA; 1 mg/ ml), 2,5 µl des 10 x Restriktionspuffers Tango (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), 20 U NcoI (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA); und H2O zu 25 µl verwendet. Die Verdau-Reaktionen wurden für 3 h bei 37 °C inkubiert. 20 µl beider Reaktionsansätze wurden schließlich in einer Co-transformation in das Y1H-aS2 Genom eingebracht (siehe 2.11.1). Der gesamte Transformationsansatz von 700 µl wurde auf 3 150 mm-Platten ausgestrichen, welche Sc-Ura-His Medium (1,7 g/l Hefe Stickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 5 g/l Ammoniumsulfat, 20 g/l Glukose, 0,8 g/l Dropout Mix, 1% [w/v] Agar, pH 5.6 (NaOH)) enthielten. Der Dropout Mix enthielt je 2 g Adeninhemisulfat, Arginin HCl, Isoleucin, Leucin, Lysin HCl, Methionin, Tyrosin, Serin, Threonin, je 3 g Phenylalanin und Tryptophan sowie 9 g Valin. Hefekolonien wuchsen daraufhin für 3-5 d bei 30 °C.

Zum Test auf Autoaktivierung wurden 24 Kolonien pro Transformationsansatz in 200 µl H2O resuspendiert. 100 µl jeder Suspension wurde 1:10 mit H2O verdünnt und zur Messung der

39 OD600 genutzt. Nach Angleichung der finalen Volumina durch 1:100 Verdünnungen der Koloniesuspensionen wurden gleiche Hefekonzentrationen zu je 3,5 µl Tropfen auf Platten mit Sc-Ura-His aufgebracht und bei 30 °C für 5 d inkubiert. Zur Determinierung der experimentellen 3 Amino-1,2,4 triazol (3AT) Konzentration, bei welcher autoaktives Wachstum inhibiert wurde, wurden die positiven Klone ebenfalls auf Sc-Ura-His Platten mit 10 mM, 20 mM, 40 mM, 60 mM und 80 mM 3AT aufgetropft. Die niedrigste Konzentration an 3AT, welche zur Inhibition des 3x33:HIS Reporters ausreichte, betrug 40 mM. Zur Vergleichbarkeit zwischen den Köderstämmen wurde dieses Kriterium zur Selektion aller weiteren Stämme genutzt.

2.11.3. Protein-DNA Interaktionsnachweis

Zum Nachweis der Bindung von TFs an Promotorabschnitte wurden jeweils 2 µl (20 ng/µl) eines Beutevektors ungeschnitten in die zuvor hergestellten Köderstämme transfiziert (siehe 2.11.1). Das Volumen eines Transformationsansatzes betrug 20 µl. Zum Vergleich der Bindungskapazitäten wurden alle Transformationsansätze auf die gleiche OD600 eingestellt und schließlich zu 3,5 µl Einheiten auf Platten mit Sc-Ura-His-Trp+40mM3AT Medium aufgetropft. Um subtile Unterschiede im Hefewachstum zu erkennen, wurden zusätzlich Verdünnungen zwischen 1:10¹ und 1:10³ hergestellt und aufgetragen. Nach 5 d Inkubation bei 30 °C wurde das Wachstum der Transformationsansätze fotographisch dokumentiert. Zur Kontrolle des Transformationserfolges wurde eine Wasserkontrolle eingeschlossen. Die Gleichheit der Transformationseffizienz wurde anhand des Hefewachstums bei niedrigen Verdünnungen auf Sc-Ura-His-Trp Medium ohne 3AT Zusatz abgeschätzt. Um eine aktivierende Eigenschaft der AD Domäne auszuschließen, wurde der „leere“ AD-exprimierende pDEST-AD Vektor transformiert. Bindungsabhängige Transaktivierungseigenschaften von AD-Fusionen wurden bei niedrigen Hefeverdünnungen auf Sc-Ura-His-Trp+ 40 mM 3AT durch Vergleich des Hefewachstums evaluiert. Der Dropout-Mix zur Herstellung dieses Mediums enthielt kein Tryptophan.

2.11.4. β-Galactosidase Assay

Hefekolonien, welche die höchste initiale Hefekonzentration aufwiesen und für 5 d auf SC-Ura-His-Trp-3AT Medium wuchsen, wurden für das β-Galactosidase-Kolonie-Filter-Lift-Assay benutzt. Dazu wurden Hefezellen von Platten auf eine Nitrozellulosemembran (Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe) übertragen und für 10 sec in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Nach dem Auftauen wurde die Membran mit der Hefeseite nach oben auf eine weitere Membran platziert, welche zuvor mit Z-Puffer/X-gal Lösung (X-gal Lösung (1,67 ml): 2mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid in N,N-Dimethylformamid; Z-Puffer (100ml):

16 g/l Na2HPO4*7H2O, 5,5 g/l NaH2PO4H2O, 0,75 g/l KCl, 0,246 g/l MgSO4*7H2O, pH 7;

β-40 Mercaptoethanol (0,27 ml)) getränkt wurde. Die Inkubation erfolgte bei 30 °C und dauerte bis zur aussagekräftigen Blaufärbung der Hefelysate, jedoch nicht länger als 4 h.