4 Ergebnisse
4.1 HDACi induzieren Histon H4-Hyperacetylierung an ALL Zelllinien
Es zeigt sich, dass 6 Stunden nach Behandlung der Zellen mit HDACi eine schwache Bande bei 14 KD mit dem acH4-AK für beide Substanzkonzentrationen nachweisbar ist.
Bei der niedrigeren Konzentration von 1 µM CBHA bleibt diese schwache Bande über 48 Stunden konstant. Dies entspricht einer geringeren Menge an acetyliertem Histon-H4.
Die höhere Konzentration von 4 µM CBHA induziert hingegen schon nach 12 Stunden eine sichtbar stärkere Bande und nach 24 Stunden ist für 4 µM CBHA eine deutliche Bande detectierbar. Dies entspricht einer hohen Menge an acetyliertem Histon H4.
Weiterhin ist zu beobachten, dass für die verwendeten höheren Konzentrationen die deutlichste Zunahme der Histon H4-Acetylierung zwischen dem Zeitpunkt 12 und 24 Stunden liegt, wie die Abbildung 4 zeigt.
Abbildung 4: Histon H4-Hyperacetylierung an den Zelllinie MHH-CALL 2 (links) und Reh (rechts) nach Be-handlung mit jeweils 4 µM CBHA und 4 µM SAHA im Zeitraum von 12 und 24 Stunden.
Auf die Darstellung der Negativ- und Positivkontrolle wurde in dieser Abbildung verzichtet. Gezeigt ist ein Ver-such von jeweils zwei unabhängig durchgeführten VerVer-suchen.
4.1.2 Semiquantitative Auswertung der Histon H4-Western Blots
Um eine bessere Vergleichbarkeit und Übersichtlichkeit der vorhandenen Western Blot Resultate zu erreichen, wurde neben der rein deskriptiven eine semiquantitative Aus-wertung der Histon H4-Western Blots durchgeführt.
12h 24h 12h 24h
4µM SAHA
4µM CBHA
ß-Actin
acH4 35 kD
14 kD
12h 24h 12h 24h
4µM SAHA
4µM CBHA 35 kD
14 kD
ß-Actin
acH4 12h 24h 12h 24h
4µM SAHA
4µM CBHA
ß-Actin
acH4 35 kD
14 kD
12h 24h 12h 24h
4µM SAHA
4µM CBHA
ß-Actin
acH4 35 kD
14 kD
12h 24h 12h 24h
4µM SAHA
4µM CBHA 35 kD
14 kD
ß-Actin
acH4 12h 24h 12h 24h
4µM SAHA
4µM CBHA 35 kD
14 kD
ß-Actin
acH4
MHH-CALL 2 Reh
1 2 3
4µM CBHA 12h 24h 48h 35 kD
14 kD
ß-Actin
acH4 1 2 3
4µM CBHA 12h 24h 48h 35 kD
14 kD
ß-Actin
acH4
Abbildung 5: Histon H4-Hyperacetylierung an der Zelllinie Z33 nach Behandlung mit 4 µM CBHA im Zeitraum von 12 bis 48 Stunden.
Wie in der Abbildung 5 zu sehen, wurde die Intensität der 14 kD-Bande in 4 Abstu-fungen kategorisiert. Dabei entspricht 1 einer schwachen, 2 einer mittelgradigen und 3 einer stark sichtbaren Bande. Die Ziffer 0 kennzeichnet keine sichtbare Histon H4-Acetylierung. Die unterschied-liche Intensitäten der 14 kD Banden wur-den für jewur-den Versuch einzeln nach dem genannten Prinzip kategorisiert und die Werte in Tabellen übertragen.
In der folgen Abbildung ist beispielhaft eine tabellarische Aufstellung der Histon H4-Acetylierungswerte für die Zelllinie Nalm 6 und die Substanz SAHA.
Zeit
Versuch Konzentration 6h 12h 24h 48h
1. Versuch 1µM 1 2 3 2
4µM 1 3 3 3
Negativkontrolle 1
2. Versuch 1µM 1 1 1 2
4µM 1 2 3 2
Negativkontrolle 0
Tabelle 4: Semiquantitative Auswertung der Histon H4-Acetylierung an den Zellinien Nalm 6 nach Behandlung mit 1µM und 4µM SAHA. Es sind Werte aus zwei unabhängigen Versuchen. Die zur Stunde 48 analysierten Negativkontrollen zeigen in manchen Western Blots eine schwache Bande.
Diese semiquantitative Darstellung ermöglicht die Ermittlung eines Acetylierungsgrades, der den Mittelwert aus den zwei unabhängigen Versuchen darstellt. Weiterhin ist es möglich einen Mittelwert aus unterschiedlichen Versuchen (z.B. eine Substanz-konzentration und vier Zelllinien) zu berechnen und als Acetylierungsgrad grafisch dar-zustellen, wie im Folgenden gezeigt.
In der Abbildung 6 ist zusammenfassend dargestellt, dass die drei Hydroxaminsäuren SAHA, CBHA, Pyroxamid und die kurzkettige Fettsäure VPA an ALL Zelllinien eine zeit- und konzentrationsabhängige Histon H4-Hyperacetylierung induzieren.
Abbildung 6: Semiquantitative Auswertung der Histon H4-Hyperacetylierung an den Zelllinien: Reh, Nalm 6, Z33, MHH-CALL 2 nach Behandlung mit SAHA, CBHA, Pyroxamid und VPA.
Jeder Wert (Acetylierungsgrad) ist Mittelwert aus jeweils zwei unabhängigen Versuchen an vier verschieden Zelllinien. Die zur Stunde 48 analysierten Negativkontrollen zeigen in manchen Western Blots eine schwache Bande. Die Mittelwerte der Negativkontrollen sind in die Grafiken eingefügt.
Im Einzelnen lassen sich aus der Abbildung 6 folgende Aussagen ableiten:
1. Die Intensität der Hyperacetylierung ist abhängig von der Substanzkonzentration.
Die niedrige Substanzkonzentration von 1 µM zeigt bei den Hydroxaminsäuren SAHA, CBHA und Pyroxamid einen geringeren Acetylierungsgrad als die Substanzkonzentrati-on vSubstanzkonzentrati-on 4 µM. Für die kurzkettige Fettsäure VPA ist dieser Unterschied für die zwei ge-wählten Konzentrationen von 0,5 mM und 1 mM nur zu den beiden ersten Messzeit-punkten erkennbar.
2. Die Stärke der Hyperacetylierung ist abhängig vom Zeitraum der Behandlung.
Nach dem ersten Messzeitpunkt von 6 Stunden steigt die Menge an hyperacetyliertem Histon H4 über 12 und 24 Stunden in jedem der durchgeführten Versuche an. Beson-ders bei der jeweils höheren Substanzkonzentration ist die Zunahme der Acetylierung sichtbar. Auffällig ist die fehlende Zunahme der Histonacetylierung bei jeweils niedrige-ren Konzentration von 1 µM bzw. 0,5 mM nach 12 Stunden. Hier ist ein Anstieg erst nach 24 Stunden zu beobachten.
SAHA + BCP- ALL Zellen
0 1 2 3 4
6h 12h 24h 48h
Zeit
Acetylierungsgrad
SAHA 1µM SAHA 4µM Negativkontrolle
CBHA + BCP- ALL Zellen
0 1 2 3 4
6h 12h 24h 48h
Zeit
Acetylierungsgrad
CBHA 1µM CBHA 4µM Negativkontrolle
Pyroxamid + BCP- ALL Zellen
0 1 2 3 4
6h 12h 24h 48h
Zeit
Acetylierungsgrad
Pyroxamid 1µM Pyroxamid 4µM Negativkontrolle
VPA + BCP- ALL Zellen
0 1 2 3 4
6h 12h 24h 48h
Zeit
Acetylierungsgrad
VPA 0,5mM VPA 1mM Negativkontrolle
3. Nach 48 Stunden ist die Histon H4-Hyperacetylierung nach Behandlung mit der je-weils höheren Hydroxaminsäurekonzentration rückläufig.
Die Hydroxaminsäurekonzentrationen von 1 µM führen nach 24 bzw. 48 Stunden zu einem konstanten Acetylierungsgrad. In den jeweils höheren Konzentrationen kommt es nach 48 Stunden dagegen zu einer Abnahme der Histon H4-Hyperacetylierungn.
4. Die unterschiedlichen HDACi induzieren eine unterschiedlich starke Histon H4-Hyperacetylierung
SAHA und CBHA zeigen die stärkste Histon H4-Hyperacetylierung zur Stunde 24, so-wie in der Folgen einen Rückgang der Acetylierung zur Stunde 48. Pyroxamid als weite-re Hydroxaminsäuweite-re ist hinsichtlich der hyperacetylieweite-renden Wirkung schwächer und zeigt ist in den ersten 12 Stunden auch in der höheren Konzentration nur einen Acety-lierungsgrad von 1.
Die Grafik der histonacetylierenden Wirkung von VPA zeigt, dass Valproat als kurzketti-ge Fettsäure in den kurzketti-gewählten Konzentrationen ein schwächeres Potential bezüglich der Histonacetylierung besitzt. Zur Stunde 48 wird auch in der höheren Konzentration nur ein Acetylierungsgrad von 1 bis 2 erreicht.
Auf eine alleinige Darstellung der vier ALL Zelllinien hinsichtlich einer möglichen diffe-renten Histon H4-Hyperacetylierung ist in dieser Abbildung verzichtet worden, da keine zelllinienspezifischen Unterschiede detektierbar waren.