HBsAg-spezifische Primer und Sonde

Die Primer TaqMan-f HBsAg und TaqMan-b HBsAg, sowie die Sonde (Sonde HBsAg), sind ebenso wie die PCR-Bedingungen der Arbeit von Pas et al. (2000) entnommen. Sie befinden sich im PreS-Gen und es wird ein Bereich von 89 Basenpaaren amplifiziert. Durch Sequenzvergleiche wurde festgestellt, dass die Primer und die Sonde in den HBV-Subtypen adr und ayw binden und damit für die in der Arbeit verwendeten Konstrukte pSM2 und pSPT1.2HBV geeignet sind.

Die optimalen Konzentrationen der Primer wurden austitriert. Hierbei wurde auf einen möglichst hohen ∆Rn-Wert (Änderung der Fluoreszenz) und einen möglichst geringen C_T-Wert (Zykluszahl) geachtet. Dazu wurde die Konzentration der Sonde (250 nM) und des Templates (ca. 1,8*10⁶ Genomkopien) konstant gehalten. Es zeigte sich, dass die Endkonzentration von 900 nM je Primer optimal für die TaqMan-PCR ist.

Im Anschluss wurde die Standardreihe, welche für die Quantifizierung der unbekannten Proben wichtig ist, optimiert. Dazu wurden verschiedene Präparationen des pSM2-Plasmides seriell verdünnt und mit optimierten Primerkonzentrationen eingesetzt. Hierbei fiel auf, dass die Abweichung bei geringer Kopienzahl sehr groß war (Abb. 12).

Abb. 12: Standardreihe von zwei verschiedenen pSM2-Präparationen und sechs verschiedenen Verdünnungsreihen

Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

Die Abbildung 13 zeigt eine typische Standardreihe mit dem Primerpaar TaqMan-f HBsAg und TaqMan-b HBsAg und der Sonde HBsAg. Auffällig ist die nur relativ geringe Änderung der Fluoreszenz ∆Rn. ∆Rn ist ein Maß für die Markierung der Sonde und damit für die Messgenauigkeit während der TaqMan-PCR entscheidend. Ändert sich die Fluoreszenz nur wenig, so sind

nur sehr große Unterschiede in der DNA-Menge messbar (siehe Material und Methoden: 13.12. Quantitative PCR / TaqMan-PCR [S. 73]).

Abb. 13: Standardwerte einer Eichgerade

Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg Die Zahlen im Diagramm geben die Kopienanzahl in 10 µl DNA pro Ansatz an. ∆Rn ist ein Maß für die Änderung der Fluoreszenz, wenn die Sonde durch die Exonukleaseaktivität der Polymerase von der zu amplifizierenden DNA-Region abgespalten wird.

1.1.1. Verschiedene DNA-Isolierungsmethoden

Da die Detektion von Plasmid-DNA einfacher ist als die viraler DNA, wurden verschiedene Möglichkeiten getestet, um eine möglichst hohe Kopienanzahl im TaqMan-PCR-Ansatz nachweisen zu können. Der Zellkultur-Überstand von 2 Tagen von HepG2.2.15-Zellen wurde hierfür entweder durch Zentrifugation oder PEG8000-Fällung konzentriert oder ohne Anreicherung eingesetzt. Außerdem wurden unterschiedliche Arten der DNA-Isolierung aus Viren getestet. Ziel war es, eine gute Reproduzierbarkeit der Werte zu erreichen.

Die TaqMan-PCR zeigte für konzentrierte, nicht weiter behandelte (Abb.

14: 2) und nicht aufkonzentrierte (Abb. 14: 5) Zellkultur-Überstände keine bzw. geringe Kopien. Bei der Isolierung der DNA mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) konnte dagegen viel DNA aus dem Zellkultur-Überstand gewonnen und nachgewiesen werden. Die Standardabweichung reichte von 45 % bei Methode 1 über 30 % bei Methode 4 und 5, bis zu 10 % bei Methode 3 (Tabelle 2). Daher schien die Aufkonzentrierung über Zentrifugation und anschließende Isolierung der DNA die sinnvollste Methode, weil hier auch die Standardabweichung am geringsten war. Ein Teil der viralen DNA-Isolierung dieser Arbeit wurde mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) durchgeführt.

1,0E+00

Abb. 14: Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden aus 80 µl HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen

1. Die DNA-Isolierung erfolgte mit Hilfe von Silica coarse nach PEG8000-Fällung (Boom et al., 1990).

2. Der Zellkultur-Überstand wurde mit einem Zentrifugal- konzentrator aufkonzentriert und die DNA nicht isoliert.

3. Der Zellkultur-Überstand wurde mit einem Zentrifugal- konzentrator aufkonzentriert und die DNA mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) isoliert.

4. Der Zellkultur-Überstand wurde mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) isoliert.

5. DNA aus Zellkultur-Überstand

Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

Tabelle 2: Darstellung des Vergleichs verschiedener DNA-Isolierungs-methoden aus HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen

Methode Kopien in

80µl ÜS Standardabweichung Kopien Prozent

Die Nummern der Methoden entsprechen denen der Abbildung 14.

Später wurde ein weiterer Kit (High pure viral nucleic acid kit [Roche]) verwendet, so dass nochmals die Methoden miteinander verglichen wurden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Aufkonzentrierung nicht unbedingt notwendig ist (Abb. 15: Tag 3 3 d unkonz.) und dass bei dem Kit von Roche die Standardabweichungen am geringsten waren. Die Freisetzung der viralen DNA durch NaOH mit anschließender Neutralisierung durch HCl erbrachte zwar eine relativ hohe Ausbeute an DNA aber die Standardabweichung war sehr hoch (Abb. 15 und Tabelle 3:

Tag 3 3 d NaOH/HCl). Für die Arbeit waren die absoluten Mengen an viraler DNA nicht relevant aber eine geringe Standardabweichung, um geringe Änderungen der Virussekretion detektieren zu können. Ein großer

Teil der Arbeiten wurde mit dem High pure viral nucleic acid kit (Roche) durchgeführt, weil es von der Handhabbarkeit nicht nur am einfachsten, sondern auch am zuverlässigsten war.

1,0E+02

Abb. 15: Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden aus 80 µl HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen

Die konzentrierten (konz.) Proben wurden alle aus dem gleichen Zellkultur-Überstand entnommen. Der Zellkultur-Überstand wurde mit PEG8000 gefällt, die Viren durch Zentrifugation über ein 20 % Sucrose-Kissen pelletiert. Die nicht aufkonzentrierten Proben (unkonz.) stammen aus einer anderen Charge. Aus den Viren des konzentrierten und nicht konzentrierten Zellkultur-Überstandes wurde durch High pure viral nucleic acid kit (Roche), QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) und Lyse mit NaOH die virale DNA isoliert.

Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

Tabelle 3: Darstellung des Vergleich verschiedener DNA-Isolierungs-methoden aus HepG2.2.15-Zellkultur-Überstand (Abb. 15)

Roche QIAGEN NaOH/HCl

Tag 1 4d (Kopien) 8.344 16.136 293.319

Standardabweichung 13% 61% 41%

Tag 2 4d (Kopien) 16.142 11.749 209.794

Standardabweichung 29% 52% 20%

Tag 3 4d (Kopien) 11.654 12.422 462.090

Standardabweichung 26% 52% 47%

Tag 3 3d (Kopien) 1.102.891 2.924.893 94.289.638

Standardabweichung 7% 34% 74%

Nähere Erläuterungen zu den Methoden sind in Material und Methoden:

13.16. Isolierung viraler DNA (S. 76) beschrieben

Die zur Isolierung der viralen DNA genutzten Zellkultur-Überstände von HepG2.2.15 Zellen (Abb. 14) sind zu einem anderen Zeitpunkt gewonnen worden, als jene, welche für Abbildung 15 genutzt wurden.

Daher sind die Mengen an viraler DNA nicht direkt vergleichbar, sondern nur je nach Charge.

Abb. 16: 1:10 Verdünnungen der viralen DNA im Gegensatz zu unverdünnter DNA

Die 1:10 Verdünnungen sind auf die 10 fache Menge umgerechnet. Die Zellkultur-Überstände sind mit einem Zentrifugalkonzentrator

aufkonzentriert, die DNA mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) isoliert.

Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

Zur Überprüfung der Annahme, ob eine Verdünnung der DNA eine bessere Reproduzierbarkeit der Werte zur Folge hat, wurde die virale DNA verdünnt und im Vergleich zur konzentrierten DNA bei der TaqMan-PCR eingesetzt. Bei der Verdünnung verringert sich zwar die Standardabweichung aber wenn man den Verdünnungsschritt wieder herausrechnet, detektiert man insgesamt weniger virale DNA (Abb. 16).