3 Ergebnisse
3.1 Grb2 interagiert mit Btk im BZR-‐Signalweg
3.1.1 Grb2 bindet über seine N-‐terminale SH3-‐Domäne an ein Polyprolin-‐Motiv von Btk Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass das ITT-‐Motiv in mIgG und mIgE-‐BZRs das Adapterprotein Grb2 rekrutieren kann und dass diese Interaktion essenziell für das gestei-‐
gerte Ca2+-‐Signal mIgG-‐exprimierender B-‐Zellen ist. Ferner konnte in Vorversuchen gezeigt
Grb2 zeigen (siehe Abb. 5, anti-‐SLP65). Die Bindung an die Domänen von Grap war wesent-‐
lich schwächer (siehe Abb. 5, anti-‐SLP65). Da ich Btk als spezifischen Interaktionspartner der Grb2-‐N-‐SH3 identifizieren konnte und die Rolle von Btk für das BZR-‐induzierte Ca2+-‐Signal in der Literatur belegt ist, habe ich diese Protein-‐Protein-‐Interaktion im Detail untersucht.
SH3-‐Domänen binden ihre Interaktionspartner über Polyprolin-‐Motive. Die meisten Interak-‐
tionspartner der N-‐terminalen SH3-‐Domäne von Grb2 besitzen ein typisches Polyprolin-‐
Btk-‐Pro2-‐WT Biotin-NH-ILKKPLPPEPAAA-COOH
Btk-‐Pro2-‐LPPV Biotin-NH-ILKKPPVPEPAAA-COOH
Abbildung 6: Die Btk-‐Polyprolin-‐Peptide sind für eine Aufreinigung von Bindepartnern nicht ausreichend. (A) Aminosäuresequenz der verwendeten biotinylierten Peptide der Btk-‐Polyprolin-‐Motive (Btk-‐Pro1 und -‐Pro2) sowie der veränderten Motive (LPPV). (B) Die in (A) dargestellten Polyprolin-‐Peptide (in einer Konzentration von 1 μM bzw. 17 μM) wurden mit Lysaten aus BZR-‐
stimulierten DG75-‐Zellen inkubiert und anschließend aufgereinigt. Die Proben wurden zusammen mit Lysat der Zellen für einen Western Blot verwendet. Dargestellt ist ein Phosphotyrosin-‐Immunoblot der Aufreinigung (anti-‐
pTyr). Anschließend wurde der Western Blot mit einem Antikörper gegen Grb2 inkubiert. Am linken Rand ist die relative molekulare Masse eines Molekulargewicht-‐
Standards in kDa angegeben. Die abgebildeten Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.
Um die Interaktion der Polyprolin-‐Motive einzeln zu überprüfen, habe ich durch die Firma Eurogentec (Seraing, Belgien) biotinylierte Peptide der beiden Btk-‐Polyprolin-‐Motive (siehe Abb. 6 A) synthetisieren lassen. Neben den Peptiden mit den intakten Polyprolin-‐Motiven wurden jeweils auch Peptide synthetisiert, in denen das typische Prolin-‐Motiv +xLPxxP durch
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I+J.!"#&.'!!N $ ! ! ! ! ! Biotin-NH-ILKKPPVPEPAAA-COOH!
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3 Ergebnisse 55 den Austausch des Lysins zu Prolin (L188P bzw. L202P) und des nachfolgenden Prolins zu Valin (P189V bzw. P203V) verändert wurde (siehe Abb. 6 A). Die Varianten werden nachfol-‐
gend als LPPV-‐Varianten bezeichnet.
Für Affinitätsaufreinigungen wurden die Peptide in einer Konzentration von 1 μM zu Lysaten von BZR-‐stimulierten DG75-‐Zellen hinzugegeben und mittels einer Streptavidin-‐Matrix iso-‐
liert. Im anschließenden Phosphotyrosin-‐Immunoblot konnten keine Phosphoproteine de-‐
tektiert werden (siehe Abb. 6 B, anti-‐pTyr). Auch der Immunoblot mit einem Antikörper gegen Grb2 zeigte kein Signal (siehe Abb. 6 B, anti Grb2, 1 μM). Selbst eine deutlich höhere Konzentration der eingesetzten Peptide (17 μM) ergab kein Grb2-‐Signal im Immunoblot (siehe Abb 6 B, anti-‐Grb2, 17 μM).
Da sich keine eindeutige Bindung zwischen den kurzen Polyprolin-‐Motiv-‐Peptiden und Grb2 nachweisen ließ, habe ich im nächsten Schritt Grb2-‐basierte Fusionsproteine hergestellt, die zum einen die gesamte Tec-‐Homologie-‐Domäne, bestehend aus Btk-‐Motiv (BM) und PRR (im Folgenden als Btk-‐BMPRR bezeichnet), zum anderen nur die PRR von Btk (im Folgenden als Btk-‐PRR bezeichnet) enthielten (siehe Abb. 7 A). Neben der jeweiligen wildtypischen (WT) Variante wurden durch gezielte Mutagenesen auch die oben beschriebenen LPPV-‐Varianten (für das N-‐terminale Polyprolin-‐Motiv als LPPV1 und für das C-‐terminale Polyprolin-‐Motiv als LPPV2 bezeichnet) hergestellt. Die Variante, in der beide Polyprolin-‐Motive inaktiviert wur-‐
den, wird als LPPV1/2 bezeichnet. Gleiche Mengen der Fusionsproteine wurden anschlie-‐
ßend für Affinitätsaufreinigungen aus Lysaten BZR-‐stimulierter DG75-‐Zellen verwendet.
Die Analyse der aufgereinigten Proteine mittels Phosphotyrosin-‐Immunoblot zeigte eine Anreicherung verschiedener Phosphoproteine (siehe Abb. 7 B, anti-‐pTyr). Dabei unterschie-‐
den sich die mit Btk-‐BMPRR und Btk-‐PRR aufgereinigten Protein-‐Banden im Wesentlichen nur in der Intensität, nicht aber in Molekulargewicht und Anzahl. Die Inaktivierung des N-‐
terminalen Polyprolin-‐Motivs (LPPV1 und LPPV1/2) führte zu einer Reduktion der Phos-‐
phobanden, vor allem unterhalb des 58 kDa-‐Markers (siehe Abb. 7 B, anti-‐pTyr, Spuren 3, 5, 7, 9). Die selektive Inaktivierung des C-‐terminalen Polyprolin-‐Motivs (LPPV2) hatte keinen Einfluß auf das Bandenmuster (siehe Abb. 7 B, anti-‐pTyr, Spuren 4, 8).
Anschließend wurde die Membran mit einem Antikörper zur Detektion von Grb2 inkubiert.
Im Gegensatz zum Phosphotyrosin-‐Immunoblot war hier kein Unterschied in der Bandenin-‐
tensität zwischen den Proben der Btk-‐BMPRR-‐ und Btk-‐PRR-‐Fusionsproteine zu erkennen (siehe Abb 7 B, anti-‐Grb2). Aber auch hier zeigte sich eine deutlich verminderte Bandenin-‐
tensität für Grb2 in den Spuren der LPPV1-‐ und LPPV1/2-‐Varianten, kein Unterschied jedoch in den Spuren der LPPV2-‐Variante im Vergleich zu den wildtypischen Fusionsproteinen.
Daraus lässt sich schließen, dass nur das N-‐terminale Polyprolin-‐Motiv Grb2 bindet und die Proteine der Phosphotyrosin-‐Banden eventuell indirekt über Grb2 aufgereinigt wurden.
Abbildung 7: Fusionsproteine der Btk-‐PRR binden Grb2 und andere Proteine, dabei ist vor allem ein intaktes N-‐terminales Polyprolin-‐Motiv entschei-‐
dend. (A) Schematische Darstellung der verwende-‐
ten GST-‐Fusionsproteine (links) und die dazu gehörige Aminosäuresequenz (rechts). (B) Die in (A) dargestellten GST-‐Fusionsproteine sowie die jeweiligen Polyprolin-‐Motiv-‐Varianten (LPPV1, LPPV2 und LPPV1/2) wurden mit Lysaten aus BZR-‐
stimulierten DG75-‐Zellen inkubiert. GST diente als Negativkontrolle. Aus den aufgereinigten Protei-‐
nen wurde ein Western Blot angefertigt, der
In Folgeexperimenten zur Differenzierung einiger Phosphobanden konnten bekannte Binde-‐
partner von Grb2 wie SHC und Dok3 stimulationsabhängig mit Hilfe der Btk-‐Fusionsproteine (Btk-‐BMPRR und Btk-‐PRR) isoliert werden (Daten nicht gezeigt). In diesen Versuchen zeigte sich auch eine Aufreinigung von Btk durch die Btk-‐BMPRR-‐Domäne, nicht aber durch die isolierte Prolin-‐reiche Region von Btk (Btk-‐PRR) (siehe Abb 8, anti-‐Btk). Die daraus resultie-‐
renden Experimente werden unter 3.3.4 beschrieben.
Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass Btk ein spezifischer Bindepartner der N-‐SH3-‐ TPEEDQILKK PLPPEPAAAP VSTSE ( AS 135 – 215)!
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RNGSLKPGSS HRKTKKPLPP TPEEDQILKK PLPPEPAAAP VSTSE (AS 171-215)!
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3 Ergebnisse 57 Polyprolin-‐Motiv entscheidend für die Bindung von Grb2 und anderen Proteinen zu sein.
Weiterhin deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die isolierten Polyprolin-‐Motive in der hier verwendeten Form als biotinylierte Peptide nicht ausreichen, um eine Bindung an andere Proteine zu ermöglichen. Möglicherweise spielen noch weitere Aminosäuren außerhalb der von mir verwendeten Peptidsequenzen oder die sterische Anordnung des Motivs bzw. bei-‐
der Motive für die Bindung an Interaktionspartner eine Rolle.
Abbildung 8: Aufreinigung von Btk mit Hilfe eines Fusionspro-‐
teins aus dem Btk-‐Motiv und der Prolin-‐reichen Region von Btk. Fusionsproteine der isolierten Prolin-‐reichen Region (Btk-‐
PRR) sowie dem Btk-‐Motiv und der Prolin-‐reichen Region (Btk-‐
BMPRR) von Btk wurden mit Lysaten aus unstimulierten (0`) und BZR-‐stimulierten (3`) DG75-‐Zellen inkubiert. Es wurde ein Western Blot angefertigt, der mit einem Antikörper zur Detek-‐
tion von Btk (anti-‐Btk) inkubiert wurde. Zur Kontrolle der Funktionalität der eingesetzten GST-‐Fusionsproteine wurde die Aufreinigung von Grb2 getestet (anti-‐Grb2). Das Ergebnis wurde nicht reproduziert, sondern weiterführende Experimen-‐
te wurden direkt begonnen.
3.2 Herstellung eines humanen Zellmodells zur Untersuchung von Btk