Gezielte Veränderung der SlCGT-Expression und ihr Einfluss auf den Stoffwechsel

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4.3 Gezielte Veränderung der SlCGT-Expression und ihr Einfluss auf

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Nun stellt sich die Frage, warum der Gehalt an Kaffeoylglukarsäure trotz erhöhter CGT-Aktivität in der T2-Generation nicht ansteigt. Möglich wäre eine Abschöpfung des Produktes für andere, bisher unbekannte Stoffwechselwege, oder eine ebenfalls unbekannte Regulation dieses Stoffwechselweges, der verhindert, dass zu viel Kaffeoylglukarsäure gebildet wird. Auch die Größe des vorhandenen Substratpools kann eine entscheidende Rolle spielen. Möglicherweise ist die Verfügbarkeit der Substrate der limitierende Faktor, während die Enzymaktivität im Überschuss vorhanden und daher unkritisch ist. Diese Möglichkeit wurde zum Beispiel für einige Enzyme des Primärstoffwechsels in sich entwickelnden Raps-Embryos gezeigt (Junker et al. 2007). Des Weiteren gelang es in unserer Arbeitsgruppe nicht, durch Überexpression der UGT84A-Gene in Arabidopsis Änderungen im Gehalt von HCA-Glucose-Estern hervorzurufen.

Auch hier scheint die Verfügbarkeit von HCAs limitierend zu sein (Meissner et al. 2008).

Möglicherweise wirkt sich eine Überexpression der SlCGT auch nur unter bestimmten Umweltbedingungen aus. Um dies näher zu untersuchen, müssten die Pflanzen der T2-Generation unter verschiedenen Umweltbedingungen angezogen oder z. B. durch Pathogene oder mechanische Verletzungen gestresst und dann noch einmal näher analysiert werden. Allerdings konnten diese Analysen im zeitlichen Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht mehr durchgeführt werden.

4.3.2 Suppression der SlCGT durch RNA-Interferenz

Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Verminderung der SlCGT-Aktivität Aufschluss über die biologische Bedeutung dieses Enzyms geben.

Eine Möglichkeit zur Herstellung von Pflanzen mit verringerter oder abgeschalteter CGT-Aktivität ist die Nutzung von Doppelstrang-RNA-Interferenz (dsRNAi; (Fire et al. 1998)).

Die Beeinflussung der Genfunktion durch das indirekte Einbringen von dsRNA in einen Organismus wurde zunächst in Pflanzen entdeckt (Napoli et al. 1990). Hier führte die Übertragung eines Gens, das für die Chalcon-Synthase codiert, in Petunien nicht zur der beabsichtigten und erwarteten Verstärkung der Blütenfarbe, sondern zu einem partiellen Verlust der Färbung. Dieses Phänomen wurde als Cosuppression benannt, da hierbei nicht nur die Expression der induzierten Transgene, sondern auch die Ausbildung der Merkmale entsprechender homologer, endogener Gene unterdrückt wurde.

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Der Mechanismus des Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS) basiert darauf, dass in die Zelle eingebrachte dsRNA als fremd erkannt und die dazu homologe mRNA des Zielgens abgebaut wird. PTGS ermöglicht das gezielte Abschalten einzelner Gene oder Gruppen von einander ähnlichen Genen (Smith et al. 2000; Wesley et al. 2001; Wesley et al. 2004). Durch die Wahl eines spezifischen Promotors für die Expression der dsRNAi-Kassette ist es außerdem möglich, bestimmte Gene gewebespezifisch zu supprimieren. Die biologische Funktion des PTGS liegt vermutlich in der Abwehr von viralen Infektionen und der Inaktivierung von Retrotransposons.

Leider gelang es im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht, transgene Tomatenpflanzen mit verminderter SlCGT-Aktivität zur erzeugen. Zwar gelang die Regeneration von 32 Pflanzen aus den transformierten Kalli, und einige Linien zeigten in der T1-Generation auch eine Verminderung der Transkriptmenge für SlCGT. In zwei dieser Linien wurde außerdem ein erhöhter Gehalt an Chlorogensäure festgestellt, der jedoch nicht mit einem verringerten Gehalt an Kaffeoylglukarsäure korrelierte. Allerdings konnten diese Ergebnisse in der nächsten Generation nicht reproduziert werden. Auch ist aus der Literatur bekannt, dass bei dsRNAi-Ansätzen in Pflanzen transgene Nachkommen häufig große Unterschiede im Grad der Suppression aufweisen. Eine vollständige Suppression ist eher die Ausnahme, weshalb es möglich ist, mit Hilfe von dsRNAi auch Gene zu untersuchen, deren konstitutive Null-Mutation letal ist. Diese charakteristischen Merkmale des PTGS in Pflanzen spricht dafür, dass wesentlich mehr transgene Linien als die getesteten 32 erzeugt und analysiert werden müssten, um eine tatsächlich supprimierte Linie zu erhalten. Die großen Unterschiede zwischen den einzelnen Linien können auch mit Positionseffekten zusammenhängen. So wurde z. B. für Arabidopsis gezeigt, dass die Chromatinstruktur die Expression des Transgens beeinflussen kann (Nagaya et al. 2005).

Wird das RNAi-Konstrukt z. B. im Bereich des Heterochromatins eingebaut, kann es möglicherweise stark an Effektivität verlieren.

Eine Mehrfach-Integration der RNAi-Konstrukte in das Genom der Tomate konnte anhand der Segregation des Selektionsmarkers belegt werden. Die T2-Generation der erzeugten RNAi-Linien waren komplett Basta^®-resistent. Bei einer Einzelkopie-Insertion würde man eine 3:1-Verteilung von resistenten zu nicht resistenten Pflanzen erwarten. So kommt es zu einer wechselnden Anzahl an Kopien der RNAi-Konstrukte in den nachfolgenden Generationen, was zu unterschiedlichen Ausprägungen des RNAi-Effektes führen kann. In einer Studie über die Effektivität von RNA-Interferenz in Arabidopsis wurde gezeigt, dass

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lediglich die Einzelkopie-Insertion einen stabilen und vor allem reproduzierbaren RNAi-Effekt hervorruft, während die RNAi-Effekte von Mehrfachkopie-Insertionen sehr unterschiedlich ausfielen und nie so effektiv wie eine Einzelkopie-Insertion waren (Kerschen et al. 2004). In einer anderen Gruppe wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass Mehrfachkopie-Insertionen teilweise einen besseren Abbau der mRNA bewerkstelligen als Einzelkopie-Insertionen (Wang et al. 2005). Der Nachteil ist allerdings, dass der RNAi-Effekt aus oben genannten Gründen nicht stabil über die Generationen hinweg aufrecht erhalten werden kann. Für zukünftige Arbeiten wäre es empfehlenswert, Linien mit homozygoten Einzelkopie-Insertionen zu finden, da in diesen Linien der RNAi-Effekt stabil über alle Generationen weitergegeben wird. Nur so kann genügend pflanzliches Gewebe von genetisch gleichen Pflanzen erhalten werden, um reproduzierbare Transkript- und Metabolitenanalysen durchzuführen. Dafür müssen zunächst Southern Blot-Analysen an Blättern der ersten transgenen Generation durchgeführt werden. Danach erfolgen Segregationsanalysen der Samen von Linien mit einer möglichen Einzelkopie-Insertion.

Zeigt sich hier eine 3:1-Aufspaltung der Nachkommen hinsichtlich der Resistenz auf den Selektionsmarker, handelt es sich tatsächlich um eine Einzelkopie-Insertion. Sind in der T3-Generation sämtliche Individuen gegenüber dem Selektionsmarker resistent, ist die entsprechende Linie homozygot. Dieser Weg ist allerdings sehr zeitaufwändig und konnte im zeitlichen Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht realisiert werden.