Gewinnung und Darstellung der Proteine

pET28a∆T7/PKD2C

Zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das C-terminale Ende des humanen 2 Proteins bedurfte es eines Proteins, das den gesuchten Abschnitt von Polycystin-2 enthielt. Zudem musste es zur Immunisierung der Mäuse möglichst „rein“ vorliegen.

Deshalb sollte das Protein mit üblichen Techniken einfach aufgereinigt werden können.

Dazu wurde das Plasmid pET28a∆T7/PKD2C, das für das C-terminale Ende des menschlichen Polycystin-2, gebunden an einen 6-fachen Histidin-Schwanz, kodiert, in den E.

coli-Stamm Rosetta hineintransformiert. Der Rosetta-Bakterienstamm wurde als Expressions-stamm ausgewählt, da er das pRARE Plasmid enthält, durch welches die Synthese von eukaryontischen Proteinen erhöht wird (in diesem Fall des humanen Polycystin-2), wenn diese Proteine Kodons aufweisen, welche in „normalen“ E. coli-Stämmen selten vorhanden sind, beispielsweise AUA, AGG, AGA, CUA, CCC und GGA.

In einem Vorversuch wurde die Kinetik der Indukution bestimmt, so dass dann die eigentliche Induktion unter optimalen Bedingungen durchgeführt werden konnte, um das gewünschte rekombinante Protein zu gewinnen (siehe 2.2.5).

Da der C-Terminus von humanem Polycystin-2 aufgrund des verwendeten Vektors pET28a an einen 6-fachen Histidin-Schwanz gebunden war, konnte das rekombinante Protein mittels Ni²⁺-Säule aufgereinigt (siehe 2.2.6) und die Proteinkonzentration bestimmt werden (siehe 2.2.8). Anschließend erfolgte die Umdialyse in 1x PBS-Puffer, da dieser schonender für die Immunisierung der Mäuse war. Durch Verwendung des Expressionsstammes Rosetta und unter optimalen Induktionsbedingungen betrug die Ausbeute an aufgereinigtem Protein ca. 6 mg pro 500 ml Kulturansatz.

Die qualitative Beurteilung der Aufreinigung erfolgte durch Gel-Elektrophorese mit einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel (siehe 2.2.10), das anschließend mit Coomassie-Lösung gefärbt wurde (Abb. 3.1). Da das rekombinante Protein später zur Immunisierung der Mäuse eingesetzt werden sollte, musste es sehr „sauber“ aufgereinigt werden, um eventuelle Immunisierungen gegen andere Proteine bzw. Proteinfragmente weitgehend zu minimieren bzw. auszuschließen. Dazu wurde anders als bei den übrigen in dieser Arbeit verwendeten Proteinen bis zu 40 µg pro Geltasche aufgereinigten Proteins mittels Gel-Elektrophorese auf seine Reinheit überprüft.

pGEX-4T-1/PKD2C

Da im Verlauf dieser Arbeit sichergestellt werden sollte, dass die gewonnenen monoklonalen Antikörper tatsächlich gegen das C-terminale Ende von Polycystin-2 gerichtet waren und nicht gegen den bei dem Immunisierungsprotein ebenfalls vorhandenen Histidin-Schwanz, war ein Protein nötig, das auch über das C-terminale Ende von Polycystin-2 verfügte, jedoch keinen Histidin-Schwanz besitzt.

Hierfür wurde das Plasmid pGEX-4T-1/PKD2C, das für ein GST-Fusionsprotein mit dem C-terminalen Ende von humanem Polycystin-2 kodiert und ursprünglicherweise von der Forschergruppe um S. Somlo stammt, zunächst in den Expressionsstamm BL21 (DE3) hineintransformiert. Da es sich bei dem rekombinanten Protein um ein GST-Fusionsprotein handelte, konnte die Aufreinigung mittels Glutathionsäule erfolgen (siehe 2.2.7). Analog dem zuvor beschriebenen Protein wurde auch das GST-Fusionsprotein aus dem elute-Puffer der Glutathion-Aufreinigung in 1x PBS-Puffer umdialysiert. Die qualitative Beurteilung der Reinheit nach der Aufreinigung erfolgte ebenfalls durch Gel-Elektrophorese mit einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel, das anschließend mit Coomassie-Lösung gefärbt wurde (Abb. 3.2). Das aufgereinigte Protein wurde später in Testungen der Überstände der Hybridomklone mittels ELISA und Western Blot verwendet.

Auch unter optimierten Induktionsbedingungen wurde lediglich eine Ausbeute von ca. 0,3 mg GST-Fusionsprotein pro 500 ml Kulturansatz erhalten, die für die Testungen der Hybridomklone jedoch viel zu gering war. Erst durch das Hineintransformieren des Plasmids in den Rosetta-Expressionsstamm, der, wie bereits beschrieben, die Synthese von eukaryontischen Proteinen erhöht, gelang es, die Ausbeute auf etwa 7 mg pro 500 ml Kultur-ansatz zu steigern.

Abb. 3.1: Darstellung des aufgereinigten Proteins. 15 µg des aufgereinigten und in 1x PBS-Puffer umdialysierten rekombinanten Proteins wurden auf einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel mittels Gel-Elektrophorese aufgetrennt und mit Coomassie-Lösung gefärbt.

Ergebnisse 51

pET21b/CIP1 (116/493)

Da im Verlauf dieser Arbeit sowohl die Seren der immunisierten Mäuse als auch später die Hybridomzellen auf Antikörper gegen den Histidin-Schwanz getestet werden sollten, bestand Bedarf nach einem Protein, das ähnlich dem rekombinanten Protein des Plasmids pET28a∆T7/PKD2C ebenfalls über einen 6-fachen Histidin-Schwanz verfügt, jedoch keine Strukturähnlichkeiten zum C-terminalen Ende von Polycystin-2 aufwies. Hierzu wurde das Plasmid pET21b/CIP1 (116/493) in den Expressionsstamm BL21 (DE3) hineintransformiert.

Da durch den Vektor pET21b ein 6-facher Histidin-Schwanz kodiert wurde und keine Strukturähnlichkeit von CIP1 zu Polycystin-2 bestand, entsprach das rekombinante Protein den gewünschten Anforderungen. Durch den Histidin-Schwanz konnte das rekombinante Protein mittels Ni²⁺-Säule aufgereinigt und anschließend ebenfalls aus dem elute-Puffer in 1x PBS-Puffer umdialysiert werden. Die qualitative Kontrolle der Aufreinigung erfolgte mittels Gel-Elektrophorese mit einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel, das mit Coomassie-Lösung gefärbt wurde (Abb. 3.3).

Bei optimalen Induktionsbedingungen wurde eine Proteinausbeute von ca. 0,4 mg pro 500 ml Kulturansatz erzielt. Da dieses Protein nur in relativ geringen Mengen benötigt wurde, konnte die geringe Ausbeute akzeptiert werden.

Abb. 3.2: Darstellung des aufgereinigten Proteins. 10 und 5 µg des aus Rosetta aufge-reinigten und in 1x PBS-Puffer umdialysierten rekombinanten Proteins wurden auf einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel mittels Gel-Elektrophorese aufgetrennt und mit Coomassie-Lösung gefärbt.

Abb. 3.3: Darstellung des aufgereinigten Proteins.

5 µg des aufgereinigten und in 1x PBS-Puffer um-dialysierten rekombinanten Proteins wurden auf einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel mittels Gel-Elektro-phorese aufgetrennt und mit Coomassie-Lösung ge-färbt.

Neben den drei bereits beschriebenen Proteinen wurde im Rahmen dieser Arbeit noch ein GST-Fusionsprotein sowie ein rekombinantes Protein mit vierfachem Histidin-Schwanz verwendet, die keine Ähnlichkeit mit Polycystin-2 aufwiesen.