CD8A O.tsu +
4.3 Eine gesteigerte Bakterienlast korreliert während einer Orientia tsutsugamushi Infektion mit einer erhöhten
IL-10-Produktion
Die bisherigen Beobachtungen entsprachen nicht der Hypothese und widersprechen den gegenwärtigen Modellvorstellungen zur Rolle der negativen Kostimulatoren. Entgegen der Erwartungen führte eine Blockade der untersuchten negativen Korezeptoren CTLA-4, PD-1, TIM-3 und LAG-3 bei einer Infektion mitO. tsutsugamushi nicht zu einer gesteigerten
T-Zell-Effektorantwort mit einer verminderten Bakterienlast in der Lunge. Im Gegen-teil dazu konnte nach einer CTLA-4 Blockade während der akuten Phase (siehe Kapitel 4.2.1.4) sowie nach einer PD-1 Blockade (siehe Kapitel 4.17) während der chronischen Phase sogar eine gesteigerte Bakterienlast in der Lunge gezeigt werden. Um eine Ursache für die gesteigerte Bakterienlast nach der Blockade von PD-1 bzw. CTLA-4 zu finden, wur-de schließlich das anti-inflammatorische Zytokin IL-10, das u. a. IFN , IL-2 und TNF-↵
hemmen soll, untersucht [267]. Mege et al. konnte bereits zeigen, dass IL-10 die Anfäl-ligkeit des Wirtes für viele intrazelluläre Mikroorganismen erhöht und für die Persistenz von Bakterien wie z.B.M. tuberculosis verantwortlich ist [255].
Eine Expression von IL-10 könnte demnach eine Erklärung für die erhöhte Bakterienlast während der O. tsutsugamushi Infektion in der Lunge nach einer frühen Blockade von CTLA-4 bzw. einer späten Blockade von PD-1 sein.
4.3.1 Eine frühe Blockade von CTLA-4 induziert eine erhöhte IL-10-Produktion in in vitro restimulierten Milzzellen
Für die Untersuchung der IL-10-Produktion nach der akuten Blockade von CTLA-4 wurden an d12 p.i. Milzzellen aus infizierten und ↵-CTLA-4 behandelten (O.tsu + ↵-CTLA-4), infizierten und nicht blockierten (O.tsu + Hamster IgG) und nicht infizier-ten aber ↵-CTLA-4 behandelten (L929 Kontrolle + ↵-CTLA-4) C57BL/6 Mäusen iso-liert und in vitro mit ↵-CD3 für 48 h restimuliert. Die Quantifizierung erfolgte mittels LEGENDplexT M Zytokin-Bead-Array (siehe Kapitel 4.24) und anschließender durchfluss-zytometrischer Messung. In Abbildung 4.24 sind die Ergebnisse der IL-10 Quantifizierung in pg/mL dargestellt.
0 5 10 15 20 25
O.tsu + Hamster IgG + CD3 O.tsu + α-CTLA-4 + CD3 L929 Kontrolle + α-CTLA-4 + CD3 O.tsu+α-CTLA-4+CD3
* *
IL-10 [pg/mL]
O.tsu α-CTLA-4
α-CD3
O.tsu Hamster IgG
α-CD3
L929 α-CTLA-4
α-CD3
Medium
Abbildung 4.24: IL-10-Produktion von restimulierten Milzzellen nach akuter Blockade von CTLA-4.Isolierte Milzzellen aus infizierten und↵-CTLA-4 behandelten (O.tsu+↵-CTLA-4), infizierten und nicht blo-ckierten (O.tsu + Hamster IgG) sowie nicht infizierten aber blockierten (L929 Kontrolle +↵-CTLA-4) C57BL/6 Mäusen wurden an d12 p.i. isoliert und in vitro für 48 h mit ↵-CD3 restimuliert. Des Weiteren ist eine Me-diumkontrolle ohne ↵-CD3 Stimulation aufgeführt (Medium). Die Konzentration von IL-10 wurde mit dem LEGENDplexT M Zytokin-Bead-Array bestimmt. Dargestellt ist die Konzentration von IL-10 in pg/mL. (Mit-telwert±SEM; n=3-5). *p‹0,05; Kruskal-Wallis-Test mit Dunnspost test.
Nach einer Restimulation mit ↵-CD3 war sowohl bei den infizierten nicht blockierten Mäusen (O.tsu + Hamster IgG +↵-CD3) als auch bei den nicht infizierten aber blockier-ten Mäusen (L929 Kontrolle + ↵-CTLA-4 + ↵-CD3) eine IL-10 Konzentration von etwa 5 pg/mL im Überstand der in vitro stimulierten Milzzellen nachweisbar. Nach einer frü-hen Blockade von CTLA-4 (O.tsu +↵-CTLA-4 + ↵-CD3) stieg die IL-10 Konzentration bei den infizierten Mäusen signifikant auf etwa 17 pg/mL an.
Es konnte also gezeigt werden, dass T-Zellen in der Milz während der Infektion mit O.
tsutsugamushi nach einer frühenin vivoBlockade von CTLA-4 und anschließenderin vitro Restimulation mit ↵-CD3 signifikant mehr IL-10 produzieren, als T-Zellen aus der nicht CTLA-4 blockierten Kontrollgruppe. Da IL-10 für seine anti-inflammatorische und Th1 hemmende Wirkung bekannt ist und außerdem bei anderen Infektionsmodellen für eine erhöhte Bakterienlast verantwortlich ist, könnte die erhöhte IL-10-Produktion auch eine Erklärung für die erhöhte Bakterienlast (siehe Abbildung 4.12) während einer Infektion mit O. tsutsugamushi sein.
4.3.2 Gesteigerte IL-10-Produktion der CD4+ T-Zellen in der Lunge nach später PD-1 Blockade
Um zu überprüfen, ob die gesteigerte Bakterienlast in der Lunge auch nach der PD-1 Blockade während der chronischen Phase der Infektion in einem Zusammenhang mit einer gesteigerten IL-10-Produktion steht, wie es auch bei der frühen CTLA-4 Blockade gezeigt
werden konnte (siehe Kapitel 4.3.1), wurde erneut die IL-10-Produktion untersucht. Dazu wurden in diesem Fall Lungenzellen von infizierten Mäusen, die mit↵-PD-1 bzw. Ratten IgG während der akuten bzw. chronischen Phase behandelt wurden, isoliert, 4 hin vitro mit PMA und Ionomycin restimuliert und anschließend mit Antikörpern gegen IL-10 und CD4 gefärbt. Die Analyse erfolgte durch eine durchflusszytometrische Messung (siehe Abbildung 4.25).
B
CD4
IL-10
O.tsu + α-PD-1
O.tsu +
Ratten IgG L929 + α-PD-1
O.tsu + α-PD-1
A
C
12 33
0 2 4
6 O. tsu + α-PD-1 O. tsu + Ratten IgG
ns
*
Zeitpunkt nach Infektion [d]
IL-10 auf CD4+ [%]
0
0
6,6
93,4 0
0
3,3
96,7 0
0
O.tsu + α-PD-1 D
SSCA
IFNγ
CD4
IL-10
IFNγ 5,47
IFNγ
IFNγ+ IL-10+ CD4+ 7,0
93,0
Abbildung 4.25: IL-10-Produktion von CD4+ T-Lymphozyten von O. tsutsugamushi infizierten C57BL/6 Mäusen nach früher und später PD-1 Blockade. Mit O. tsutsugamushi infizierte C57BL/6 Mäuse wurden dreimalig mit jeweils 250µg↵-PD-1 (O.tsu +↵-PD-1) bzw. Ratten IgG (O.tsu + Ratten IgG) ip. sowohl in der akuten Phase als auch in einem zweiten Experiment in der chronischen Phase behandelt. Als Kontrollgruppe dienten nicht infizierte aber blockierte Mäuse (L929 Kontrolle +↵-PD-1). Isolierte Lungenzellen wurden mit Antikörpern für 4 h mit PMA/Ionomycin in vitro restimuliert und anschließend mit Antikörpern gegen CD4 (V500), IL-10 (Alexa Fluor 700) und IFN (FITC) gefärbt. Es folgte eine durchflusszytometrische Messung. (A) Dargestellt sind exemplarische Dot Plots für eine Maus je Gruppe an d33 p.i.. (B) Dargestellt ist die IL-10-Produktion in % der CD4+Lungenzellen. (Mittelwert±SEM; n=5). *p‹0,05, ns = nicht signifikant; Mann Whitney-Test (zweiseitig). (C) Zeigt einen Dot Plot einer infizierten und blockierten Maus (O.tsu +↵-PD-1), bei der IFN aller Lymphozyten gezeigt wird. (D) Dargestellt ist ein Dot Plot einer infizierten und blockierten Maus, bei der im Gate die IFN + IL-10+ CD4+ T-Zellen an d33 p.i. dargestellt sind (Kasten).
Eine frühe Blockade von PD-1 zeigte an d12 p.i. keinen Einfluss auf die IL-10-Produktion von CD4+Lungenzellen (B; links). Sowohl bei blockierten (O.tsu+↵-PD-1) als auch nicht blockierten Mäusen (O.tsu + Ratten IgG) lag die IL-10-Produktion bei etwa 0,5 % der
CD4+ T-Zellen. Eine PD-1 Blockade während der chronischen Phase führte hingegen zu einer signifikant gesteigerten IL-10-Produktion von 5 % der CD4+ T-Zellen im Vergleich zu nicht blockierten Mäusen, bei denen 3 % der CD4+ T-Zellen positiv für IL-10 zu messen waren (A; B, rechts). Im Rahmen dieser Arbeit wurde nicht primär nach Zellen geschaut, die zusätzlich zu IL-10 auch weitere Zytokine produzieren, da es nicht Teil der Ausgangshypothese war. Trotzdem konnte im Rahmen dieser Arbeit zumindest qualitativ gezeigt werden, dass die IL-10 produzierenden CD4+T-Zellen gleichzeitig Produzenten für IFN sind (D; Kasten). Dafür mussten zunächst die IFN + T-Zellen aller Lymphozyten (C) definiert werden. Bei den IFN + IL-10+ koproduzierenden Zellen handelt es sich jedoch nicht um Produzenten von IL-2 (Daten nicht gezeigt).
Die in Kapitel 4.2.2 aufgeführten Ergebnisse zeigten zwar, dass eine späte Blockade von PD-1 zu einer gesteigerten Zytokinproduktion von IFN und IL-2 während einer Infektion mit O. tsutsugamushi führte. Allerdings konnte trotzdem die Bakterienlast in der Lunge nicht reduziert werden, sondern lag an d33 p.i. sogar erhöht vor. Vergleichbar mit den Er-gebnissen nach einer frühen CTLA-4 Blockade konnte auch nach der chronischen Blockade von PD-1 gezeigt werden, dass eine erhöhte Bakterienlast in Verbindung mit einer ver-mehrten Produktion von IL-10 steht (siehe Abbildung 4.25). Diese IL-10+ CD4+ T-Zellen produzierten zudem IFN . Allerdings müssten für quantitative Aussagen diesbezüglich weitere Untersuchungen folgen.
4.3.3 Unveränderte IL-10-Produktion nach einer kombinierten Blockade von PD-1, TIM-3 und LAG-3
Um zu sehen, ob auch nach einer kombinierten Blockade von PD-1, TIM-3 und LAG-3 ohne eine veränderte Bakterienlast in der Lunge eine veränderte IL-10-Produktion vor-liegt, oder ob dies ausschließlich der Fall bei einer erhöhten Bakterienlast ist, folgte eine Untersuchung von IL-10 in isolierten Lungenzellen. Dazu wurden O. tsutsugamushi infi-zierte (O.tsu + ↵-PD-1/↵-TIM-3/↵-LAG-3) und nicht infizierte Mäuse (L929 Kontrolle +↵-PD-1/↵-TIM-3/↵-LAG-3) während der akuten bzw. chronischen Phase der Infektion mit einer Kombination aus ↵-PD-1, ↵-TIM-3 und ↵-LAG-3 behandelt. An d12 p.i. bzw.
d33 p.i. wurden Lungenzellen isoliert und für 4 hin vitro mit PMA und Ionomycin resti-muliert. Anschließend wurden die Zellen mit Antikörpern gegen CD4 und IL-10 gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert (siehe Abbildung 4.26).
12 33 0
2 4 6 8
10 O. tsu + α-PD-1/α-TIM-3/α-LAG-3 O. tsu + Ratten IgG
ns
ns
Zeitpunkt nach Infektion [d]
IL-10 der CD4+ [%]
B CD4
IL-10
O.tsu +
kombinierte Blockade O.tsu + Ratten IgG IgG
A
d33 p.i.
L929 + kombinierte Blockade 0
0
0
0
0
0 3,7
96,3
3,6
96,4
3,9
96,1
Abbildung 4.26: IL-10-Zytokinexpression auf CD4+ Lungenzellen nach früher und später kombi-nierter Blockade von PD-1, TIM-3 und LAG-3.O. tsutsugamushi infizierte C57BL/6 Mäuse wurden mit einer Kombination aus jeweils 250µg↵-PD-1, 200µg↵-TIM-3 und 100µg↵-LAG-3 (O.tsu + ↵-PD-1/↵-TIM-3/↵-LAG-3) bzw. Ratten IgG (O.tsu+ Ratten IgG) während der akuten bzw. chronischen Phase der Infektion ip.
behandelt. An d12 bzw. d33 p.i. wurden Lungenzellen isoliert und mit Antikörpern gegen CD4 (V500) und IL-10 (Alexa Fluor 700) nach einer 4 hin vitroRestimulation mit PMA/Ionomycin gefärbt und durchflusszytometrisch bestimmt. (A) Gezeigt sind exemplarische Dot Plots der IL-10 Färbung an d33 p.i.. (B) Dargestellt sind die IL-10+ Zellen in % der CD4+ pulmonalen T-Zellen an d12 bzw. d33 p.i.. (Mittelwert ±SEM; n=5). ns = nicht signifikant; Mann Whitney-Test (zweiseitig).
Auf die IL-10-Produktion der CD4+pulmonalen Zellen hatte die kombinierte Blockade von PD-1, TIM-3 und LAG-3 weder während der akuten noch während der chronischen Phase der Infektion einen Einfluss. An d12 p.i. lag die IL-10-Produktion in beiden Mausgruppen bei etwa 0,5-1 % der CD4+ T-Zellen. An d33 p.i. stieg die IL-10-Produktion zwar auf etwa 3 % an, blieb jedoch trotzdem unbeeinflusst von einer kombinierten Blockade.
Es konnte demnach gezeigt werden, dass die nach einer kombinierten Blockade von PD-1, TIM-3 und LAG-3 unveränderte Bakterienlast in der Lunge also einer gleichbleibenden IL-10-Produktion gegenübersteht.
Die zu Beginn der Arbeit aufgestellte Hypothese, dass eine Blockade von negativen Ko-rezeptoren zu einer verstärkten Immunantwort mit einer verminderten Bakterienlast bei einer Infektion mit O. tsutsugamushi führt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit durch verschiedene einzelne und kombinierte experimentelle Ansätze widerlegt.
Anders als erwartet, führte die Blockade von CTLA-4 während der akuten Phase und die Blockade von PD-1 während der chronischen Phase sogar zu erhöhten Bakterienlasten in der Lunge. Die gezeigte erhöhte Bakterienlast steht dabei jeweils in Korrelation mit einer gesteigerten Produktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10. Die Daten aus Kapitel 4.3.2 deuten zudem darauf hin, dass es sich bei den IL-10 produzierenden Zellen nach einer Blockade von PD-1 während der chronischen Phase der Infektion um CD4+ T-Zellen handelt, die IFN koproduzieren.
5 Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Informationen über den Einfluss der koinhi-bitorischen Rezeptoren CTLA-4, PD-1, TIM-3 und LAG-3 während einer Infektion mit O. tsutsugamushi ermittelt werden. Das Ziel war, ihren Einfluss auf die T-Zell-vermittelte Immunantwort sowie deren Folgen für den Infektionsverlauf zu untersuchen. Aufgrund verschiedener Arbeiten anderer Arbeitsgruppen, in denen eine Blockade inhibitorischer Korezeptoren zu einer gesteigerten T-Zell-Immunantwort mit einer gesteigerten Pathogen-abwehr führt, bestand die Arbeitshypothese darin, dass die negative T-Zell-Kostimulation auch bei einer Infektion mitO. tsutsugamushi die Effektorantwort inhibiert und eine ent-sprechende Blockade zu einer Verbesserung der Pathogenabwehr führt.