III. Teil 2: „ Rhodopsin 7-Projekt“
2.2. Genetische Methoden
2.2.1. Das UAS-Gal4-System
Das UAS-Gal4-System ist ein in vivo System, welches aus zwei transgenen Fliegenlinien besteht:
einer sogenannten Gal4-Treiber-Linie und einer UAS-Linie. In der Gal4-Treiber-Linie wird ein natürlicherweise nicht vorkommender Transkriptionsfaktor (Gal4) aus Hefe unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors exprimiert. Kreuzt man die Treiber-Linie mit einer bestimmten UAS-Linie, so bindet Gal4 an die UAS-Sequenzen und induziert so die Expression des
Rh1-Promotor rh7-Gen Rh1 3`UTR y-Gen (marker)
EcoR 1 Hind III Xho I
Not 1
Rh1-Promotor rh7-Gen Rh1 3`UTR y-Gen (marker)
EcoR 1 Hind III Xho I
Not 1
gewünschten Gens. Auf diese Weise ermöglicht dieses System in vivo die durch den Promotor der Treiber-Linie spezifizierte räumlich und zeitlich gerichtete Expression eines bestimmten DNA-Abschnitts oder Gens. In dieser Arbeit wurden von S. Veleri (2005) hergestellte Rh7-Gal4-Linien (unter Kontrolle des Rh7 Promoters) mit yw;UAS-GFP Fliegen gekreuzt (Tab. 3). Das GFP (Green Fluorescent Protein) wurde somit unter Kontrolle verschiedener Rh7-Treiberlinien exprimiert.
2.2.2. Keimbahntransformation und Herstellung genetisch stabiler Transformanten
Mit Hilfe des Quiagen® Plasmid Midi Kits wurde die für die Injektion in Fliegenembryos bestimmte DNA, die wie in Kapitel 2.3.2 amplifiziert wurde, aufgereinigt. Daraufhin wurde die DNA in sterilem Wasser gelöst. Nach Zentrifugation der DNA und Zugabe von 10x Injektionspuffer und Lebensmittelfarbstoff (zur Kontrolle der injizierten DNA-Lösung) wurde die DNA-Lösung auf eine Konzentration von 300ng DNA/µl eingestellt.
Nach manueller Dechorionisierung auf Klebeband und kurzer Trocknungsphase auf Silikagel wurden die Embryonen mit Voltalev Öl (Atofina) überschichtet, um eine weitere Austrocknung zu verhindern. Injiziert wurde in ca. 30-60 Min. alte yw;+;ki ∆2-3 Embryonen (syncytiales Stadium), in zwei Ansätzen zu je 30 bzw. 80 Embryonen, die bezüglich der Transposase heterozygot waren. Die Injektion der DNA in das Polplasma erfolgte mit Hilfe von Injektionskapillaren (Eppendorf), der erforderliche Druck (etwa 1 bar) wurde mit Hilfe einer Stickstoffflasche mit Druckminderer erzeugt. Im 18°C Raum schlüpften überlebende Larven auf Apfelagarplatten. Die Larven wurden dann in Gläsern mit dem beschriebenen Fliegenbrei überführt.
Die sich daraus entwickelnden Fliegen wurden anschließend mit dem Stamm yw;+;+
rückgekreuzt. Die Nachkommen dieser Fliegen wurden auf dunkle Körper (Das yellow Gen war der Marker des P-Elements) hin untersucht und zum Bestimmen des Insertionschromosoms folgendermaßen weitergekreuzt.:
Fliegen mit dunklen Körpern, die auch keine Transposase enthielten (und daher nicht den Marker ki = kinked trugen), wurden entweder mit Fliegen der Balancerstämme des zweiten Chromosoms yw;Bl/CyO;+ oder des dritten Chromosoms yw;+;H/TM3 gekreuzt. (Fliegen, die nach wie vor den den Marker „kinked“ trugen, wurden verworfen). Die daraus resultierenden Nachkommen mit dunklen Körpern und den jeweiligen Balancern wurden erneut mit dem entsprechenden Balancerstamm gekreuzt. Wenn die Nachkommen dieser Kreuzungen dann dunkle Körper hatten und keine Balancer mehr zu erkennen waren, konnte davon ausgegangen werden, dass sich das P-Element auf dem zweiten bzw. dritten Chromosom befand. Mehrere homozygote Linien mit
dem P-Element auf dem zweiten Chromosom (yw;Rh1-Rh7;+) und dritten Chromosom (yw;+;Rh1-Rh7) konnten so etabliert werden.
2.2.3. Herstellung der knock-out Mutante durch P-Element Remobilisierung
Um die Funktion des RH7 Proteins nachweisen zu können wurde auch eine Rh7 knock-out Linie hergestellt, um durch vergleichende Studien eines möglichen Rh7 knock-out Phänotypes mit dem Phänotyp von Wildtypstämmen Einblick in die Funktion des Proteins gewinnen zu können. Es stellte sich heraus, dass der Stamm (y1w67c23; P{EPgy2}EY13118) mit einem P-Element-Insert in einer Entfernung von 147bp in 5’ Richtung vor dem ersten Intron des rh7-Gens bereits existiert (Abb. 16). Dieser Stamm wurde vom Bloomington Stock Center bezogen.
3`
5`
P(EPgy2)EY1118
rh7 (CG 5638)
Exon 1
143bp
3`
5`
P(EPgy2)EY1118
rh7 (CG 5638)
Exon 1
143bp
Abb. 16: Schema, das die Lage des P-Elements im rh7-Gen (Stamm: BL 21406) darstellt.
Durch Kreuzen des Stammes BL 21406 mit dem Transposasestamm yw;+;ki∆2-3 wurde das P-Element remobilisiert. Da die Quote einer Deletion im Vergleich zu einer präzisen Excision äußerst gering ist, wurden 220 Einzelkreuzungen angesetzt. Um einer Rekombination vorzubeugen wurden die heterozygoten Männchen der F1-Generation mit Jungfrauen des Balancerstammes yw;+;H/TM3 gekreuzt. Die F2-Generation, die nur den Balancer und helle Körper hatten wurden mit dem Balancerstammes yw;+;H/TM3 erneut gekreuzt, um in der F3-Generation Fliegen mit dem Genotyp yw;+;Pө/TM3 zu bekommen. Die Fliegen dieses Genotyps wurden miteinander gekreuzt, um stabile, homozygote Fliegen ohne P-Element zu erhalten (yw;+;Pө/Pө). Daraufhin wurden Deletionskartierungen vorgenommen, um zu testen, ob es sich um Revertanten oder echte Deletionslinien handelte. Die genaue Erklärung der Deletionsstelle (mit Schema) liegt im Kapitel 3.1.2.2. und Abb. 18 vor.
2.2.4. Etablierung einer doppelt homozygoten Linie des Rh1-Rh7-Konstrukts im ninaE- Hintergrund
Zur Optimierung der Funktionsanalyse des RH7 Proteins wurde der Stamm yw;+;ninaE und der Stamm yw;Rh1-Rh7;+ in den Doppelbalancerstamm yw;Sp/CyO;TM2/MKRS eingekreuzt.
Dadurch wurden in der F1-Generation die Stämme yw;Rh1-Rh7/CyO;TM2/MKRS bzw.
yw;Sp/CyO;TM2/ninaE erhalten. Die Fliegen dieser Genotypen wurden untereinander gekreuzt um in der F2- Generation homozygote Tiere der Genotypen yw;Rh1-Rh7/Rh1-Rh7;TM2/MKRS oder yw;Sp/CyO;ninaE/ninaE zu erhalten. Die F2-Generationen wurden nun gegeneinander gekreuzt, um yw;Rh1-Rh7/CyO;TM2/ninaE Fliegen zu erhalten. Durch erneutes Kreuzen der F3-Generation aus diesen Nachkommen konnten die Balancer ausgekreuzt werden, das Resultat war die Etablierung des doppelt homozygoten Stammes yw;Rh1-Rh7/Rh1-Rh7;ninaE/ninaE.
2.3. Molekularbiologische Methoden