2.5.1 Fliegenzucht
Die Fliegen werden auf einem Standardmedium (Ashburner, 1989) bei 18°C, RT und 25°C gehalten. Eiablagen werden auf Apfelsaft-Agarplatten angesetzt und zur Stimulation der Eiablage mit ein wenig Hefe bestrichen.
Standardmedium: 356g Maisschrot, 47,5g Sojamehl, 84g Trockenhefe, 225g Malzextrakt, 75ml 10%
Nipagin, 22,5ml Propionsäure, 28g Agar, 200g Zuckerrübensirup und mit 4,9l dH2O auffüllen
Apfelsaft-Agarplatte: 40g Agar und 340ml Apfelsaft (100%) mit dH2O auf 1l auffüllen, aufkochen, nach Abkühlen auf 60°C mit 30ml 10% Nipagin versetzen und auf Platten gießen
2.5.2 Fliegenstämme
Im Folgenden sind alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Fliegenstämme aufgelistet.
Bezeichnung Genotyp Beschreibung Referenz
Wildtyp Wildtyp Oregon R, rote
Augen
w; Gla/Cyo,
P{ftz::lacC} w; Gla/Cyo, P{ftz::lacC}
trägt Glaced
FM7 {twi::GFP} FM7 {twi::GFP}
trägt FM7
Durch das entwickelte UAS-GAL4-System ist es möglich, die Genexpression zeitlich und räumlich zu beinflussen (Brand und Perrimon, 1993). Hierbei exprimiert ein als Aktivator bezeichneter Fliegenstamm (siehe Abbildung 2.2) den Hefe-Transkriptionsfaktor GAL4, welcher normalerweise nicht in der Fliege vorkommt. In einem zweiten Fliegenstamm, dem Effektor, steht ein zu untersuchendes Zielgen unter
der Kontrolle von sogenannten UAS-Sequenzen (upstream activating sequences).
Diese UAS-Sequenzen besitzen Bindungsstellen für GAL4. Durch die Kreuzung von Aktivator und Effektor gelangen beide Komponenten des Systems in eine Fliege und führen so zur UAS-GAL4 vermittelten Expression des Zielgens unter der Kontrolle des Enhancers.
Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des UAS-GAL4-Systems. Das System wird benutzt, um ein bestimmtes Gen (bzw. Zielprotein) zeit- und gewebespezifisch zu exprimieren. Hierfür wird ein Aktivatorstamm mit einem Effektorstamm verkreuzt und dadurch in der nächsten Generation die Expression des Zielproteins durch den Transkriptionsfaktor GAL4 gesteuert.
2.5.4 Kreuzungen zur Rettung der Letalität von rngo-mutanten Fliegen mittels des UAS-GAL4-Systems
Das mutante Allel von rngo ist pupal letal. Man kann, wenn die Embryonen vorsortiert werden, einen sehr geringen Prozentsatz an Escaper-Fliegen bekommen, die aber nicht fertil sind und nach kurzer Zeit sterben. Um zu überprüfen, ob die Letalität wirklich
nur auf das mutante Allel von rngo zurückzuführen ist, werden Rettungskreuzungen mit Fliegen durchgeführt, die ein über das UAS-GAL4-System exprimiertes Transgen tragen. Bei diesen Transgenen handelt es sich um das wildtypische Volllängen-Gen, welches ein C-terminales oder N-terminales GFP-Tag trägt. Dadurch kann zeitgleich die Funktionalität der Transgene getestet werden. Hierzu werden Kreuzungen von Jungfrauen angesetzt, die das mutante Allel von rngo (GE3956) über dem FM7c-Balancer tragen. Zu diesen Weibchen werden Männchen gesetzt, die auf dem dritten Chromosom das UAS-Konstrukt tragen. Dieses Konstrukt wurde mit einem GAL4-Treiber (hier daughterless-GAL4) rekombiniert und über TM3 balanciert.
2.5.5 Keimbahntransformation von Drosophila melanogaster
Durch die Keimbahntransformation können auf einfache Weise transgene Fliegen erzeugt werden. Hierbei wird der Gentransfer durch transponierbare Elemente, die sogenannten P-Elemente, erreicht. Diese benötigen flankierende Erkennungssequenzen (inverted repeats) und eine Transposase, um in ein Genom inserieren zu können. Im P-Element-Transformationsvektor lokalisiert die zu übertragende DNA zwischen den inverted repeats während auf einem gesonderten Helferplasmid die Transposase zur Verfügung gestellt wird. Beide Plasmide werden in Embryonen von Drosophila melanogaster injiziert und können so zufällig in das Genom inserieren. Die Injektion der Plasmide, sowie das anschließende Auskreuzen der Fliegen, zur Bestimmung des Insertionsortes, werden wie in Kapitel 4 des Buches Drosophila Methods and Protocols von A. Bachmann und E. Knust beschrieben, durchgeführt (Bachmann und Knust, 2008).
2.5.6 Erzeugung von GFP-Keimbahnklonen mittels des FRT-FLP-Systems
Die Erzeugung von Keimbahnklonen kommt oft zur Anwendung, wenn homozygot mutante Tiere nicht lebensfähig sind und eine maternale Komponente besitzen, die mögliche Phänotypen in der Oogenese oder Embryogenese maskiert. Hierbei wird in heterozygot mutanten Tieren eine homozygot mutante Keimbahn erzeugt und so die maternale Komponente ausgeschaltet. So können Aussagen darüber gemacht werden, ob und in wieweit das Gen für die Oogenese oder die Entwicklung des Embryos
notwendig ist. Für die Induzierung von Klonen in der Keimbahn wird das FRT (flipase recombination target)-FLP (Flipase)-System verwendet (Chou und Perrimon, 1992).
Die Flipase unterliegt der Kontrolle eines Hitzeschockpromotors und katalysiert eine spezifische Rekombination der FRT-Sequenzen, welche aus 599bp invertierten Sequenzwiederholungen bestehen. So kann in heterozygoten Fliegen, welche diese FRT-Sequenzen tragen, mit Hilfe der Flipase eine mitotische Rekombination zwischen diesen Chromosomen stattfinden und homozygot mutante Zellen entstehen (Golic und Lindquist, 1989).
Für die Erzeugung von GFP-Keimbahnklonen werden Jungfrauen, die das mutante Allel von rngo mit einer FRT Sequenz tragen, mit Männchen gekreuzt, die auf dem ersten Chromosom ein GFP-Konstrukt als Marker aufweisen und auf dem zweitem Chromosom die Flipase tragen. Die Flipase auf dem zweiten Chromoson katalysiert dann während des zweiten Larvenstadiums die mitotische Rekombination zwischen den FRT-Sequenzen (Abbildung 2.3). Der Hitzeschock für die Aktivierung der Flipase erfolgt im zweiten Larvenstadium an zwei aufeinanderfolgenden Tagen für jeweils 2h bei 37°C im Wasserbad.
Abbildung 2.3: Kreuzung zur Herstellung von GFP-Keimbahnklonen. Für die Generierung von Keimbahnklonen wird ein GFP-Markerkonstrukt zusammen mit dem mutanten Allel für rngo, mit FRT Sequenzen und einer Flipase in eine Fliege eingekreuzt. Nach einem Hitzeschock vermittelt die Flipase eine mitotische Rekombination zwischen den FRT Sequenzen, so dass homozygot mutante Keimzellen entstehen.
In den sich entwickelnden heterozygoten Tieren entsteht eine für das rngo Allel homozygot mutante Keimbahn. Als Marker wird hierfür GFP verwendet. Eikammern, die homozygot oder heterozygot für das GFP-Konstrukt sind, tragen noch eine wildtypische Kopie des rngo Allels. Eikammern, die kein GFP exprimieren sind homozygot mutant und können so von den heterozygoten unterschieden werden.
2.5.7 Erzeugung von GFP-Follikelzellklonen mittels des FRT-FLP-Systems
Follikelzellen umgeben die Keimzellen, sind somatischen Ursprungs und besitzen eine ausgeprägte apiko-basolaterale Polarität. Deshalb kann man in diesem Zelltyp gut die Auswirkungen von mutanten Allelen auf die Zellpolarität untersuchen. Für die Erzeugung von Follikelzellklonen wird das FRT-FLP-System in ähnlicher Weise wie bei der Erzeugung von Keimbahnklonen verwendet, nur wird hier der Hitzeschock bei 3-5 Tage alten Fliegen für jeweils 1h bei 37°C vorgenommen und die Ovarien nach weiteren 3-5 Tagen präpariert.