Generierung des targeting Vektors (Rekombinations-Vektor)

Für die Herstellung des targeting Vektors, welcher ein „gefloxtes“ APRIL-Gen sowie eine von FRT-Seiten flankierte Antibiotika-Resistenzkassette enthält, wurde die 1998 von Zhang und Mitarbeitern entwickelte Methode der lamda-vermittelten Red®/ET® basierten homologen Rekombination in E.coli verwendet (Zhang et al., 1998). Die aus Phagen stammenden Proteinpaare RecE/RecT (Rac-Prophage) und Redα/Redβ (λ-Phage) katalysierten dabei den Vorgang der homologen Rekombination, wobei RecE oder Redα als 5‘-3‘ Exonukleasen und RecT oder Redβ als Anlagerungsproteine einzelsträngiger DNA fungieren (siehe Abbildung 27).

101 Die Generierung des Rekombinations-Vektors erfolgte in zwei Schritten: zunächst wurde ein spezifischer Abschnitt des APRIL-Gen aus dem Bacmid RP23-117B19 in ein Minimalvektor-Plasmid pMV subkloniert. Anschließend wurde das APRIL-Gen im Plasmid pMV-APRIL zum Rekombinations-Vektor pMV-APRIL-KO modifiziert, indem spezifische loxP-Erkennungssequenzen für die Cre-Rekombinase ins APRIL-Gen integriert und zudem eine von FRT-Seiten flankierte Neomycin-Resistenzkassette für die Selektion der transgenen ES-Zellen inseriert wurde.

Vor allem die Länge des homologen Bereichs (Homologiearme) im targeting Vektor spielt für die Spezifität und somit für die Rekombinationsfrequenz des Vektors ins murine Genom der ES-Zellen eine wichtige Rolle (Thomas et al., 1992). Der Bereich der Homologiearme im Rekombinations-Vektor und somit der Abschnitt des APRIL-Gens, der in den Minimalvektor-Kontext subkloniert werden sollte, wurde freundlicherweise von Dr. Sibylle Blumenthal von Gene Bridges (Heidelberg) festgelegt.

Auch die Integrationsbereiche der loxP-Rekombinationssequenzen, sowie der von FRT-Seiten flankierten Neomycin-Resistenzkassette, wurden anhand ihrer Vorschläge bestimmt. Aufgrund der Red®/ET®-Methodik konnte ohne Restriktionsenzyme gearbeitet werden, so dass bei der Wahl der Integrationsstellen keine Einschränkungen wegen spezifischer Restriktionsschnittstellen vorlagen.

Nach den Vorschlägen von Dr. Sibylle Blumenthal wurde für die Subklonierung des APRIL-Gens der Abschnitt ab Intron 1 (295 bp vor Exon 2) bis zum Ende des Gens (3' downstream Bereich) gewählt.

Die Homologiearme, über die der Rekombinations-Vektor ins murine Genom integriert wird, wiesen dabei jeweils eine Länge von etwa 3 kb auf, da die loxP-Erkennungssequenzen für die Cre-Rekombinase in Intron 2 und 5 des APRIL-Gens integriert wurden. Die von FRT-Seiten flankierte Neomycin-Resistenzkassette wurde ebenfalls in das Intron 5 inseriert. Im späteren knockout

Abbildung 27: Schematische Darstellung des Prinzips der Red®/ET® basierten homologen Rekombination

(verändert nach dem Handbuch zur Red®/ET®

basierten homologen Rekombination von Gene Bridges, Heidelberg)

Die 5’-3’ Exonukleasen RedE oder Redα degradieren im Reparaturprozess nach einem DNA-Doppelstrangbruch überhängende 5‘-Enden und produzieren 3’-Einzelstränge. An diese lagern sich die Einzelstrang-DNA (ssDNA) Anlagerungsproteine RedT oder Redβ an, was die Verknüpfung homologer Regionen ermöglicht.

Ebenso werden überhängende Enden wie Homologiearme von PCR-Fragmenten von RedE oder Redα prozessiert und von RedT oder Redβ gebunden, was die zielgerichtete, Red/ET vermittelte homologe Rekombination ermöglicht.

102 Mausmodell würde die Cre-vermittelte Rekombination der loxP-Rekombinationsstellen in Intron 2 und 5 zu einer Deletion der Exons 3, 4 und 5 führen. Diese Deletion resultierte im Fehlen der Aminosäuren 69-228 und somit der Abwesenheit funktioneller Domänen wie dem nuclear export signals NES, den leucine rich repeats LRR 3 und 4 sowie Teilen der highly acidic Domäne, was die Expression eines nicht-funktionellen APRIL Proteins zur Folge hätte.

4.2.1.1 Subklonierung des APRIL-Gens

Die Subklonierung des Gens aus dem Bacmid RP23-117B19 erfolgte über spezifische APRIL-Homologiearme, welche über PCR als Primer JC08#27 und JC08##28 an das Grundgerüst des Minimalvektors, ein 2.642 bp großes DNA-Fragment mit einem ColE1 origin of replication sowie einem Ampicillin-Resistenzgen, angelagert wurden (siehe Abbildung 28A). Anschließend wurde das nun 2.742 bp große PCR-Amplifikat im 1 % Agarosegel überprüft (siehe Abbildung 28B) und in Bacmid-haltige E.coli Bakterien transformiert. Über homologe Rekombination fand der Austausch der homologen DNA-Sequenzen statt und das APRIL-Gen wurde aus dem Bacmid in den Vektor überführt. Katalysiert wurde der Vorgang von den Proteinpaaren RecE/RecT und Redα/Redβ, die vom Expressionsplasmid pRedET exprimiert wurden. Abbildung 28C zeigt das Vorgehen schematisch.

Abbildung 28: Schematische Darstellung der Subklonierung des APRIL-Gens:

A) Anlagerung der für Intron 1 und 3‘ downstream homologen APRIL-Arme (orange) mittels PCR an das Minimalvektor-Grundgerüst. Die Primersequenz ist in 5‘ – 3‘ Richtung angegeben und die homologe APRIL-Sequenz farblich gekennzeichnet (orange).

B) Überprüfung des 2.742 bp großen Minimalvektor PCR-Produkts nach Anlagerung der APRIL-Homologiearme im 1 % Agarosegel.

C) Subklonierung des APRIL-Gens, von Red/ET-Proteinpaaren katalysiert: die Homologiearme lagern sich an die homologen Zielsequenzen im APRIL-Gen an und das APRIL-Gen wird aus dem Bacmid herausgezogen.

103 Trotz der für APRIL-spezifischen Homologiearme wurden bei der Red®/ET® basierten Subklonierung des APRIL-Gens viele unspezifische Nebenprodukte in das Minimalvektor-System eingeführt, was die Identifizierung eines positiven APRIL-Subklons mittels Restriktionsanalyse und anschließender Sequenzierung erschwerte. Um die Auswahl möglicher positiver Subklone zunächst einzuschränken, wurde von einem Plattenabdruck aller Klone eine Filterkolonie-Hybridisierung durchgeführt. Mittels der radioaktiv-markierten Sonde JC08#12, die im Intron 3 des APRIL-Gens hybridisiert, wurden im Autoradiogramm nur APRIL-haltige Subklone kenntlich gemacht (siehe Abbildung 29A). Eine Auswahl dieser Subklone (1-9) wurde anschließend mittels Restriktionsanalyse, PCR und Sequenzierung auf das Vorhandensein des subklonierten APRIL-Abschnitts untersucht.

Die Restriktionsanalyse mit dem Restriktionsenzym Sal I, welches im Grundgerüst des Minimalvektors schneidet, diente der Größenbestimmung der Klone 1-9. Die exakte Vektorgröße konnte mittels der Restriktionsanalyse nicht ermittelt werden, dennoch wies Klon #7 als einziger Klon annähernd die Größe des Minimalvektorgröße von 17.968 bp auf (siehe Abbildung 29B) und wurde in weiteren Untersuchungen genauer analysiert. Eine Kontroll-PCR mit den spezifischen APRIL-Primern JC08#21 und JC08#22, die im Intron 1 und 3‘ downstream Bereich des Gens hybridisieren und somit das

Abbildung 29: Identifizierung des APRIL-Subklons pMV-APRIL #7

A) Filterkolonie-Hybridisierung: Von der Sonde JC08#12 detektierte Klone im Autoradiogramm des Plattenabdrucks

B) Kontroll-Restriktionsanalyse der Klone 1-9 mit Sal I: Die erwartete pMV-APRIL Größe von 17.968 bp konnte in etwa einzig bei Klon #7 (siehe roter Pfeil) nachgewiesen werden, alle anderen Klone wiesen trotz Filterkolonie-Hybridisierung unspezifische Nebenprodukte auf. Als Marker wurde der 1 kB DNA-Ladder von NEB verwendet.

C) PCR-Produkt des Minimalvektor-Grundgerüstetes (3.085 bp) im 1 % Agarosegel, amplifiziert mit spezifischen APRIL-Primern JC08#21 und JC08#22. Als Marker wurde der 1kB DNA-Ladder von NEB verwendet.

104 Minimalvektor-Grundgerüst in einer Größe von 3.085 bp aus dem APRIL-Gen amplifizierten, bekräftigten das Ergebnis für Klon #7 aus der Restriktionsanalyse (siehe Abbildung 29C). Die darauf folgende Sequenzierung des Vektors von Klon #7 bestätigte die Subklonierung des APRIL-Abschnitts von Intron 1 bis zum Ende des Gens in ein Minimalvektor-Plasmid, so dass das pMV-APRIL Konstrukt von Klon #7 in den folgenden Schritten für die weitere Modifizierung des APRIL-Gens zur Herstellung des APRIL targeting Vektors pMV-APRIL-KO verwendet wurde.

4.2.1.2 Modifizierung des APRIL-Gens

Die Integration der ersten loxP Erkennungsstelle in Intron 2, 568 bp vor Exon 3, erfolgte über den Einbau einer „gefloxten“ Antibiotika-Resistenzkassette von 1.737 bp Größe. Diese wurde unter Verwendung der Cre-Rekombinase anschließend wieder entfernt, so dass aufgrund des loxP-spezifischen Rekombinationsmechanismus eine loxP-Rekombinationssequenz im Intron 2 zurückblieb (siehe Abbildung 31A). Die Insertion dieser „gefloxten“ Antibiotika-Resistenzkassette erfolgte wie auch schon bei der Subklonierung des APRIL-Gen Abschnitts durch homologe Rekombination über spezifische APRIL-Gen-Homologiearme. Diese wurden durch PCR (JC08#16 und JC08#17) an das kommerziell erhältliche template der „gefloxten“ Resistenz-Kassette angefügt (siehe Abbildung 31B).

Die Insertion sowie die darauf folgende Cre-vermittelte Deletion der „gefloxten“ Resistenz-Kassette wurde durch Restriktionsanalyse (Daten nicht gezeigt) und mittels PCR (JC08#16 und JC08#17) überprüft (siehe Abbildung 31B). Nach erfolgreicher Integration der Kassette konnte im 1 % Agarosegel ein Amplifikat von 1.978 bp detektiert werden, das nach der Deletion der „gefloxten“

Antibiotika-Resistenzkassette nur noch eine Größe von 428 bp aufwies (siehe Abbildung 31C). Die anschließende DNA-Sequenzierung bestätigte, 568 bp von Exon 3 entfernt, die erfolgreiche Insertion der 1. loxP-Rekombinationssequenz in Intron 2.

105 Die zweite loxP-Erkennungssequenz wurde in Kombination mit einem von FRT-Seiten flankierten Kanamycin/Neomycin-Resistenzgen von 1.677 bp Länge über die von den Primern JC08#18 und JC08#19 angelagerten Homologiearme ins Intron 5 entsprechend integriert (siehe Abbildung 31C).

Der Einbau wurde durch Restriktionsanalyse (Daten nicht gezeigt) sowie einer Kontroll-PCR mit den für die Homologiearme verwendeten Primern (JC08#18 und JC08#19) überprüft (Abbildung 31D).

Abbildung 30: Teil 1 der Modifikation des APRIL-Subklons pMV-APRIL zum targeting-Vektor pMV-APRIL-KO A) Schematische Darstellung der Insertion loxP-Rekombinationssequenz: eine „gefloxte“ Antibiotika-Resistenzkassette wurde über Homologiearme in Intron 2 von pMV-APRIL integriert. Über den Cre-Rekombinationsmechanismus wurde die Resistenzkassette deletiert, es verbleibt eine loxP-Sequenz im Intron 2, welche als 1. loxP-Erkennungssequenz bezeichnet wird.

B) Anlagerung der Homologiearme an die „gefloxte“ Antibiotika-Resistenzkassette über die Primer JC08#16 und JC08#17.

C) PCR-Kontrollen der Insertion (1.978 bp) und anschließenden Deletion (428 bp) der „gefloxten“ Antibiotika-Resistenzkassette Insertion der 2. loxP-Rekombinationssequenz mit den Homologiearm-Primern JC08#16 und JC08#17; DNA Ladder 1 kb (links) und 100 bp (rechts) von NEB.

106 Es folgte eine finale Sequenzierung des Rekombinations-Vektors pMV-APRIL-KO, in welcher alle Exon-Bereiche sowie hinzugefügten Modifikationen überprüft und bestätigt wurden. Das fertige Konstrukt wurde anschließend mit Sal I für den Einbau ins murine Genome linearisiert und aufgereinigt.