Der Vergleich der Methoden Gelelektrophorese und Pyrosequenzierung zur Analyse der DNA-Sequenz anhand der Untersuchung des ERCC1-Polymorphismus wurde sowohl mit Zelllinien als auch mit Patientenproben durchgeführt (siehe auch 2.5.5). Je nach Ausprägung des Polymorphismus in Codon 118 können die Varianten `AAC´ und/oder `AAT´ vorliegen. Dies bedeutet, dass bei diploidem Chromosomensatz eine homozygote Ausprägung mit den Varianten `AAC´ (C/C) oder `AAT´ (T/T) oder eine heterozygote Ausprägung mit den Varianten
`AAC´ und `AAT´ in der selben Zelle (C/T) vorliegen kann. Bei den ersten Analyseversuchen fiel auf, dass sich die Ergebnisse der Gelelektrophorese nicht immer eindeutig den einzelnen oben genannten Ausprägungen zuordnen ließen. Dies betraf nicht nur Patientenproben, deren Fehleranfälligkeit größer war, sondern auch Zelllinien, bei denen eine Kontamination ausgeschlossen werden konnte.
In den Abbildungen 9 bis 14 sind zunächst Beispiele für eindeutige Befunde des ERCC1-Polymorphismus anhand von Zelllinien und Patientenproben dargestellt. Die Ergebnisse der Gelelektrophorese der Zelllinien DLD1 und RKO (in Abbildung 9) zeigen in der rein visuellen Auswertung bei DLD1 in der rechten Spalte zwei Banden, die durch den erfolgten Restriktionsverdau entstanden sind. Hier konnte das Enzym BsrDI (Verfahren siehe auch
Abbildung 9: Gelelektrophorese zum ERCC1 Nachweis bei den Zelllinien DLD1 und RKO: Die jeweils linke Spalte enthält das PCR-Produkt, die rechte Spalte das Produkt nach BsrDI-Restriktionsverdau.
Abbildung 10: Ergebnis der Pyrosequenzierung des ERCC1-Polymorphismus: DLD1 zeigt zu 97% T/T, RKO zeigt zu 90% C/C.
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2.5.4.7) binden und die DNA schneiden, womit der Nachweis für das Vorliegen der T/T-Variante erbracht war. In der jeweils linken Spalte einer Probe ist, ebenso wie in allen folgenden Abbildungen der Elektrophorese-Gele, das unverdaute PCR-Produkt als Referenz getestet worden. Die Zelllinie RKO zeigte im Vergleich keinen Unterschied zwischen verdautem und unverdautem PCR-Produkt in der Gelelektrophorese. Hier konnte das Restriktionsenzym also nicht binden und somit lag in diesem Fall die Variante C/C vor. Diese Ergebnisse wurden in der Pyrosequenzierung bestätigt. In beiden Verfahren sind keine weiteren Banden beziehungsweise Peaks zu sehen.
Ein größtenteils eindeutiges Ergebnis war bei den Patienten mit den Batchnummern 4417 und 4477 zu sehen. Hier wurde jeweils sowohl gesundes Gewebe, also tumorfreie Mukosa als auch Tumorgewebe untersucht. In den Abbildungen 11 bis 14 sind die Ergebnisse des Restriktionsverdaus mit Elektrophorese und der Pyrosequenzierung gegenübergestellt.
Mukosa wie auch Tumorgewebe von Patient 4417 zeigten im Gel und durch die quantitative Bestimmung mittels Pyrosequenzierung, hier mit 95%, die Expressionsvariante T/T. Bei Patient 4477 lag dagegen die heterozygote Ausprägung mit C/T vor. Im Gel sind deshalb, nach der Inkubation mit dem Restriktionsenzym BsrDI, drei Banden zu erkennen. Da bei heterozygoter Ausprägung beide Genvarianten vorliegen, wurde ein Teil der vorhandenen DNA durch das Enzym geschnitten, was zu zwei neuen Banden führte, während der andere Teil, als dritte Bande, unverändert blieb. Die schwächere Darstellung der Banden im Tumorgewebe von
Abbildung 11: Patient 4417: Gelelektrophorese zum Nachweis der ERCC1-Ausprägung in tumorfreier Mukosa und Tumor. In der linken Spalte jeweils das PCR-Produkt, in der rechten Spalte DNA nach Restriktionsverdau mit BsrDI
Abbildung 12: Ergebnis der Pyrosequenzierung des ERCC1-Polymorphismus bei Patient 4417 in der tumorfreien Mukosa sowie im Tumorgewebe: Jeweils 95% T/T.
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4477, bei dem die unterste Bande kaum noch sichtbar war, stellt bereits ein Beispiel für die Schwierigkeit einer präzisen Auswertung dar. Dieses Problem bildete die Grundlage für die Entwicklung eines alternativen Analyseverfahrens, der Pyrosequenzierung. Mit ihr konnten die Anteile der beiden Ausprägungsvarianten in Prozent ausgegeben werden. Somit ergab die Pyrosequenzierung bei dem Patient 4477, mit 38% Anteil „T“ in der Mukosa und 29% Anteil
„T“ im Tumor, den Befund C/T. Allerdings spiegelte sich auch hier die schwächere Ausprägung im Tumor wider.
Während sich einige eindeutige Ergebnisse mit beiden Methoden gut darstellen ließen, eignete sich, bei unscharfen oder schwachen Banden im Gel, die Pyrosequenzierung deutlich besser. Dies zeigte beispielsweise das Elektrophoresegel der Zelllinie HT29 (Abbildung 15).
Hier ist die Aussage über die Ausprägungsvariante von ERCC1 schwierig, da der Unterschied in der Intensität der Banden sehr hoch ist. Es könnte sich sowohl um die Ausprägung C/C mit einem Artefakt als auch um die Variante C/T handeln. Erst durch die Pyrosequenzierung (Abbildung 16) ist ersichtlich, dass die zweite Option, also die Ausprägung C/T, mit einer Verteilung von 70% zu 30% vorliegt.
Abbildung 13: Patient 4477: Gelelektrophorese zum Nachweis der ERCC1-Ausprägung in tumorfreier Mukosa und Tumor. In der linken Spalte jeweils das PCR-Produkt, in der rechten Spalte DNA nach Restriktionsverdau mit BsrDI.
Abbildung 14: Ergebnis der Pyrosequenzierung des ERCC1-Polymorphismus bei Patient 4477 in der tumorfreien Mukosa sowie im Tumorgewebe: Ausprägung C/T mit 62/38% bzw. 71/29%.
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Ähnlich schwierig gestaltete sich die Interpretation der Patientenproben 4459 und 4464 (Abbildungen 17 bis 20). Auch wenn sich die Gewichtung der Anteile von C und T durch die Prozentangaben aus der Pyrosequenzierung in der Intensität der Banden im Gel widerspiegelten, war mit der alleinigen Gelelektrophorese keine eindeutige und vor allem keine sichere Aussage über die Ausprägung möglich. Insbesondere die quantitative Darstellung der DNA-Menge in den verschiedenen Banden des Gels war kaum einzuschätzen und erlaubte damit keine sichere Aussage über das vorliegende Material. Zudem könnten Artefakte die Aussagekraft einschränken. Für den Untersucher bleibt damit generell eine höhere Unsicherheit bei der Auswertung, welche bei der Verwendung der Pyrosequenzierung entfällt.
Zusammengefasst bietet die Pyrosequenzierung nicht nur eine modernere und weniger fehleranfällige Darstellung, sondern außerdem die Möglichkeit, einen Cutoff-Wert festzulegen, der eine bessere und sicherere Auswertbarkeit zulässt.
Links: Abbildung 15: Gelelektrophorese zum Nachweis der ERCC1-Ausprägung in der Zelllinie HT29. Die linke Spalte enthält das PCR-Produkt, die rechte Spalte das Produkt des BsrDI-Restriktionsverdaus.
Oben: Abbildung 16: Pyrosequenzierung des ERCC1-Polymorphismus der Zelllinie HT29.
Ausprägung C/T mit einem Verhältnis von 70%/30%
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Abbildung 17: Gelelektrophorese zum Nachweis der ERCC1-Ausprägung bei 4459.
Abbildung 18: Pyrosequenzierung des ERCC1-Polymorphismus bei 4459.
Abbildung 19: Gelelektrophorese zum Nachweis der ERCC1-Ausprägung bei 4464.
Abbildung 20: Pyrosequenzierung des ERCC1-Polymorphismus bei 4464.
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