Funktionelle Charakterisierung von MATE1 in transfizierten HEK293-Zellen

Als Methoden zur Untersuchung, ob MATE1 in den transfizierten HEK293-Zellen funktionell aktiv war, wurden Aufnahmeversuche mit dem radioaktiven Modellsubstrat [³H]-MPP gewählt [118]. MATE1 ist zwar in der Literatur vorwiegend als Efflux-transporter bekannt [118], [157], dennoch wurde hier die Aufnahme von Substraten über MATE1 gemessen. Dies war experimentell leichter durchzuführen und es schien

auch sinnvoll, weil Dangprapai et al. gezeigt haben, dass MATE1 eine bidirektionale und symmetrische Transportaktivität besitzt. Symmetrisch bedeutet, dass sich die Ergebnisse von Aufnahmeversuchen nicht signifikant von entsprechenden Effluxversuchen unterscheiden [29].

Die Versuche orientierten sich an den in unserer Arbeitsgruppe für andere SLC-Transporter adaptierten Bedingungen [60], [150]. Die funktionelle Aktivität von MATE1 wurde durch drei Ergebnisse zunächst in transient, dann in stabil transfizierten Zellen nachgewiesen.

Die mit dem ursprünglichen Expressionsvektor MATE1-pCMV-SPORT6 transient transfizierten und die mit dem zweiten Expressionsvektor MATE1-pEF/FRT/V5 transfizierten Zellen zeigten bei einem pH-Wert von 7,4 beide eine signifikant höhere [³H]-MPP-Aufnahme als die Kontrollzellen. Untereinander verglichen war die Aufnahmerate dabei in den mit MATE1-pCMV-SPORT6 transfizierten Zellen höher als die mit MATE1-pEF/FRT/V5 transfizierten Zellen. Ursache könnten die verschiedenen Promotoren der Vektoren und eine unterschiedliche Effektivität der Transfektion sein (siehe 3.2). Da MATE1 Substrate gegen Protonen austauscht, ist seine Aktivität pH-abhängig. Ein höherer extrazellulärer pH-Wert, also ein erhöhter auswärts gerichteter Protonengradient sollte demnach zu einer erhöhten Triebkraft für die [³ H]-MPP-Aufnahme führen, falls eine MATE1-vermittelte H]-MPP-Aufnahme vorliegt. Dies wurde hier bei einem von 7,4 auf 8,5 erhöhten pH-Wert beobachtet und damit wurden die Ergebnisse von Otsuka und Tanihara bestätigt, die eine maximale Transportaktivität von MATE1 bei pH 8,5 zeigten [118]. Als weiterer Beleg für eine funktionelle MATE1-Expression in den transient transfizierten HEK293-Zellen wurde eine Hemmung durch unmarkiertes MPP beobachtet. Die Begründung ist, dass durch den sehr viel höheren Anteil an unmarkiertem MPP sehr viel weniger markiertes Substrat an die Bindungsstellen der MATE1-Moleküle binden kann und so die Transportrate von [³H]-MPP verringert wird.

In mit MATE1-pEF5-FRT-Vektorkonstrukten stabil transfizierten Zellen konnten diese drei Ergebnisse ebenfalls reproduziert werden. Erstens lag eine MATE1-vermittelte [³ H]-MPP-Aufnahme vor, welche etwa zweimal so hoch wie die in nicht exprimierenden Kontroll-zellen war. Zweitens wurde auch in den stabil transfizierten Zellen bei pH 8,5 eine erhöhte [³H]-MPP-Aufnahme gemessen, die wie oben erwähnt einen Hinweis auf die MATE1-vermittelte Aufnahme gab. Die MATE1-vermittelte Aufnahme von 1 µM [³H]-MPP bei pH 8,5 betrug nach 5-minütiger Aufnahme das 3,9-fache der Rate in Kontrollzellen.

Tanihara et al haben dagegen eine 8,7-fache Aufnahme von 4 nM MPP nach 15-minütiger Aufnahme gezeigt. Diese im Vergleich zu unseren Ergebnissen höhere

5 Diskussion 104 Aufnahme könnte an der längeren Transportzeit liegen. Drittens inhibierten die unmarkierten Substanzen MPP, TEA und Chinin die Aufnahme von [³H]-MPP. TEA ist ebenfalls ein MATE1-Substrat [139], [157]. Tanihara et al. haben eine 2,3-fache Aufnahme von MPP im Vergleich zu TEA mit KM–Werten von 0,10 ± 0,02 mM für MPP und 0,38 ± 0,07 mM für TEA, aber keine Interaktion von MATE1 mit Chinin gezeigt. Wir haben eine Inhibierung der [³H]-MPP-Aufnahme von etwa 86 % durch 500 µM unmarkiertes MPP und etwa 61 % durch TEA bei pH 8,5 gefunden. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Tanihara et al. wurde in den in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten zudem eine MATE1-vermittelte Inhibierung durch Chinin beobachtet.

In den in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten lagen im Vergleich zu den in der Literatur beschriebenen Versuchen andere Bedingungen, wie Konzentration, Temperatur und Transportzeit vor [157], so dass kein direkter Vergleich der hier gewonnenen mit den in der Literatur beschriebenen Ergebnissen möglich ist [139], [157]. Die drei oben diskutierten Beobachtungen belegen aber eine Aktivität von MATE1 in den transfizierten HEK293-Zellen und die Zellen konnten für die weitere Charakterisierung von MATE1 genutzt werden.

Um weitere Kenntnisse zur Transportaktivität von MATE1 zu gewinnen, wurde untersucht, ob die MATE1-Aktivität an NHE3 gekoppelt ist. Dieser ist wie MATE1 in der luminalen Membran der proximalen Tubuluszellen exprimiert [10]. NHE3 transportiert Protonen aus Zellen heraus und nimmt im Austausch dazu Natriumionen in die Zellen auf. Der entstehende einwärts gerichtete Protonengradient könnte die Triebkraft für den im Effluxmodus transportierenden MATE1 darstellen.

In dieser Arbeit wurden Experimente an HEK293-Zellen durchgeführt, die auch NHE3 exprimierten [88]. Durch Inhibierung von NHE3 mit dem Hemmstoff Amilorid [36], bzw.

der Senkung seiner Triebkraft durch natriumfreie Versuchslösungen, sollte eine erhöhte intrazelluläre Protonenkonzentration bewirkt werden. Die Folge einer Kopplung von NHE3 und MATE1 wäre eine erhöhte Aufnahme von [³H]-MPP gewesen. Die Ergebnisse zeigten allerdings im Gegenteil eine Inhibierung der [³H]-MPP-Aufnahme in HEK293-Zellen bei Abwesenheit von Natriumionen. Damit wurde, wie von Ohta und Imamura für das Protein der Ratte, eine direkte Natriumabhängigkeit des humanen MATE1-Transporters gezeigt [114]. Es konnte so aber nicht festgestellt werden, dass MATE1 mit NHE3 gekoppelt ist. Unter Anwesenheit von Amilorid war die [³H]-MPP-Aufnahme ebenfalls verringert anstatt erhöht, wie es bei einer Kopplung von NHE3 und MATE1 zu erwarten gewesen wäre. MATE1 ist also wie NHE3 sensitiv für Amilorid. Auf Grund dessen kationischer Struktur könnte es auch ein Substrat oder Inhibitor von MATE1 sein,

da MATE1 vornehmlich Kationen transportiert [157]. Damit konnte auch mit diesem Versuchsansatz nicht nachgewiesen werden, dass NHE3 und MATE1 miteinander gekoppelt sind.