Frequenz und Zeitpunkt der Transposition von GTDsB

Die Faktoren, die den entscheidenden Einfluss auf die Frequenz und den Zeitpunkt der Transposition haben sind zum einen die Transposase und zum anderen die Position der mobilen gene trap-Konstrukte im Genom.

Um die Transpositionsfrequenz von GTDsB in dem Zweikomponentensystem zu evaluieren wurden die F1- und F2-Generation der gene trap(GT)-Population in Southernblotanalysen untersucht. In 9 von 79 getesteten Pflanzen (11%) der GT-F1-Generation konnten Transpositionen des GTDsB-Konstrukts detektiert werden (Tab. 6). In Gerste wurde bisher für die Transposition von nicht-autonomen Ds-Elementen in der F1-Generation eine Frequenz von 2% (Koprek et al. 2000) und für autonome Ac-Elemente von 1,5% gezeigt (Scholz et al.

2001). Für das nicht-autonome gene trap-Konstrukt GTDsA konnte in Gerste eine Transpositionsfrequenz in der F1-Generation von 2,4% nachgewiesen werden (Bergmann 2003), wobei mit 28 die Anzahl analysierter Pflanzen klein war. In den Southernblotanalysen der GT-F2-Generation konnten in 49 der 191 getesteten Pflanzen unabhängige Transpositionen des GTDsB-Konstrukts detektiert werden (Tab. 6), was einer Frequenz von 26% entspricht. Die Transpositionsfrequenz von GTDsB ist im Vergleich zu den bisher für die Transpositionsfrequenzen von Ac/Ds-Elementen in Gerste publizierten Daten von 1-2% in der F1-Generation (Koprek et al. 2000, Scholz et al. 2001) und 16% in der F2-Generation (Koprek et al. 2000) in diesem System erhöht. Das in der GT-F2-Generation eine höhere Transpositionsfrequenz als in der GT-F1-Generation detektiert werden konnte, begründet sich darin, dass in den Analysen der GT-F2-Generation Transpositionen, die in der GT-F1-Generation und der GT-F2-GT-F1-Generation stattgefunden haben detektiert werden können. Die Transpositionsfrequenz von 26% in der GT-F2-Population ist auch mit den bisher in dem monokotylen System Reis gezeigten vergleichbar. In der Studie von Greco et al. (2001) zur Transposition von autonomen Ac-Elementen in Reis wurde in den Nachkommen von drei unabhängigen Primärregeneraten eine Transpositionsfrequenz von 33% festgestellt. Kolesnik et al. (2004) konnten in ihrem Ac-basierten gene trap-System in eine germinale Transpositionsfrequenz von 51% in der F2-Generation feststellen. In einer anderen Studie wurde eine mittlere Transpositionsfrequenz für Ac von 18,4% berichtet (Enoki et al. 1999).

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Transposition von GTDsB in der GT-F2-Population zeigen, dass die Transpositionsaktivität von GTDsB in den Nachkommen unabhängiger GTDsB-Parentallinien stark variiert. Auch in anderen Untersuchungen konnte eine Varianz der Transpositionsfrequenzen in unabhängigen Linien beobachtet werden. Koprek et al.

(2000) konnten in ihrem Zweikomponentensystem in Gerste für nicht-autonome Ds-Elemente in der F2-Generation variable Transpositionsfrequenzen von 0-47% ermitteln. Dabei zeigten Nachkommen von 50% der 24 F1-Linien eine Transpositionsfrequenz von 0-20%, die restlichen 12 eine Transpositionsfrequenz von 20-47%. Enoki et al. (1999) konnten in vier unterschiedlichen transgenen Familien variable Transpositionsfrequenzen für Ac von 40,9%, 22,5%, 8,3% und 19% feststellen. Auch in einer anderen Studie von autonomen Ac-Elementen in Reis variieren die Transpositionsfrequenzen in den Nachkommen von drei Linien aus unabhängigen Primärregeneraten von 15-50% (Greco et al. 2001). Kolesnik et al.

(2004) konnten in ihrem Ac-basierten gene trap-System in Reis für die Nachkommen von 13

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unabhängigen Kreuzungskombinationen eine germinale Transpositionsfrequenz von 16-73%

in der F2-Generation feststellen.

Die in den Southernblotanalysen der GT-F2-Population ermittelten Transpositionsraten (Tab. 6) wurden für unabhängige GTDsB-Parentallinien berechnet. Die Transpositionsfrequenz variiert in den Nachkommen unabhängiger GTDsB-Parentallinien von 5-67% (Tab. 12). Die Anzahl an getesteten Pflanzen pro unabhängiger GTDsB-Parentallinie ist mit 9 bis 60 klein, so dass die Ergebnisse nur als Hinweise gewertet werden.

Tab. 12: Transpositionsfrequenzen in der F2-Generation unabhängiger GTDsB-Parentallinien

GTDsB-Parentallinie Anzahl der

GTDsB-Insertionsloci Anzahl der

analysierten Pflanzen Unabhängige

Transpositionsereignisse Transpositionsfrequenz in %

2a 1-2 10 2 20

23 1-2 14 7 50

31B 2 9 2 22

6c/6a 2-4 18 5 28

31A 4 11 2 18

16 3-5 15 5 33

14A 5-6 9 1 11

11 5-8 60 11 18

10 6-7 21 1 5

14B 8-10 12 5 42

26 12 12 8 67

Summe 191 49 26

Die unabhängigen GTDsB-Parentallinien differieren stark in der Zahl an GTDsB-Integrationsloci. Alle GTDsB-Parentallinien enthalten mindestens ein vollständiges GTDsB-Konstrukt (Abb. 7). Darüber hinaus muss aufgrund der Ergebnisse der Southernblotanalysen angenommen werden, dass in der Mehrheit der Linien eine variable Anzahl an weiteren Kopien vorliegt, die rearrangiert sein können (Tab. 3). Aufgrund der Hinweise auf Rearrangements (Tab. 3) muss davon ausgegangen werden, dass nicht alle GTDsB-Kopien zur Transposition fähig sind. Für die Transposition von Ac/Ds-Elementen müssen die ca. 240 bp-langen subterminalen Sequenzen und die 11 bp-langen TIR konserviert sein (Kunze 1996, zur Übersicht). Es sind zudem aufgrund von funktionalen Unterschieden jeweils ein 5’ und ein 3’Ende obligatorisch für die Transposition. Direkter DNA-Transfer wie bei der biolistischen Transformation von Pflanzengeweben ist dafür bekannt häufig zu multicopy-Insertionen an einem einzelnen Locus zu führen (Kohli et al. 1998). Einen deutlichen Vorteil in diesem Zusammenhang bietet die Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation mit T-DNA. Diese Methode resultiert in der Integration von einer bis wenigen Kopien des Transgens in das Pflanzengenom (Dai et al. 2001). Die Transformation von Gerste mit T-DNA wurde Mitte der 90iger Jahre erstmals beschrieben (Tingay et al. 1997).

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Die in den Nachkommen unabhängiger GTDsB-Parentallinien variierende Transpositionsfrequenz spiegelt möglicherweise Effekte der chromosomalen Position der GTDsB-Konstrukte auf die Transposition wieder. Kolesnik et al. (2004) haben die Transpositionsfrequenz für unabhängige Ds-Linien in Präsenz der gleichen Transposase-Quelle verglichen und festgestellt, dass der Ds-Donorlocus die Transposition beeinflusst. Bereits in Mais wurde eine große Varianz der Transpositionsfrequenz von Ac/Ds-Elementen beobachtet. Die germinale Exzisionsfrequenz von Ac und Ds an unterschiedlichen Loci kann von 0,01% bis über 15% variieren (Döring 1989, zur Übersicht).

Die für den Transpositionsvorgang essentielle Transposase erkennt die hexameren Motive AAACGG in den subterminalen Sequenzen an beiden Enden von Ac (Kunze und Starlinger 1989). In diesen TPase-Bindestellen befinden sich potentielle Methylierungsstellen und die DNA-Bindung durch die Transposase ist von dem Status der Methylierung der Ziel-DNA abhängig (Kunze 1996). Die Methylierung in Pflanzengenomen ist ein wichtiger Faktor der Regulation (Finnegan et al. 1998, Finnegan 2000, zur Übersicht). Das Muster der Methylierung entsteht zum einen durch die Weitergabe der Methylierungsmuster nach der DNA-Replikation durch maintenance-Methyltransferasen zum anderen durch eine de novo-Methylierung von neu replizierter DNA. Die Verteilung von Methylcytosin in Pflanzengenomen ist nicht zufällig. Am stärksten ist repetitive DNA im Heterochromatin methyliert (Bennetzen et al. 1988, Bennetzen 1996).

In Zusammenhang mit der Bedeutung der genomischen Position für die Transpositionsfrequenz kann sich durch eine größere Anzahl an GTDsB-Integrationsloci, die Wahrscheinlichkeit, dass sich funktionale Elemente an günstigen genomischen Positionen befinden, erhöhen. Die beiden GTDsB-Linien 23 und 26, die mit 50% und 67% die beiden höchsten Transpositionsraten zeigen, differieren mit 1-2 bzw. 12 stark in der Anzahl der GTDsB-Integrationsloci (Tab 12). Die Southernblotanalysen der Linie GTDsB 12 indizieren eine große Zahl an rearrangierten Konstrukten (Tab. 3). Insgesamt weisen die Ergebnisse darauf hin, dass erwartungsgemäß die Position der GTDsB-Elemente im Genom und potentielle Rearrangements dieser einen stärkeren Einfluss auf die Transpositionsfrequenz haben als die Anzahl der Integrationsloci.

Für die Effizienz des gene trap-Systems ist die Weitergabe einer hohen Anzahl von unabhängigen Transpositionen an die Nachkommen von Bedeutung. Die Größe der notwenigen gene trap-Population mit Insertionen des gene trap-Konstrukts in möglichst vielen Genen kann so verringert werden. Der Zeitpunkt der Transposition in der Entwicklung einer Pflanze bestimmt die Vererbung der Transpositionsereignisse an die Nachkommen.

Transpositionen früh in der Pflanzenentwicklung können an alle Nachkommen weitergegeben werden. Wenn das gene trap-Konstrukt zu einem späten Zeitpunkt in der Entwicklung der Pflanze transponiert, in den keimbahnkompetenten Zellen, erhalten die Nachkommen unabhängige, germinale Transpositionsereignisse.

Ein entscheidender Faktor, der den Zeitpunkt der Transposition bestimmt ist die Expression der Transposase. Es wurde gezeigt, dass ein hoher Level an Transposase-Expression mit Transpositionen früh in der Entwicklung korreliert (Balcells und Coupland 1994, Jones et al.

1989, Keller et al. 1993, Long et al. 1993). Koprek et al. (2000) konnten beobachten, dass in

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Pflanzen, in denen die Transposase unter Kontrolle des starken Ubiquitin-Promotors exprimiert wurde, mehrere Nachkommen das gleiche Muster an Transpositionsereignissen aufweisen. Im Gegensatz dazu enthielten Pflanzen, in denen die Transposase unter der Kontrolle des Ac-Promotors exprimiert wurde, eine hohe Anzahl an Transpositionen, die spät in der Entwicklung oder direkt in den Keimbahn-kompetenten Zellen stattgefunden haben müssen. Sie schließen daraus, dass die Expression der Transposase durch den Ac-Promotor zu einer höheren Zahl an unabhängigen Transpositionen führt, die an die nächste Generation weitergegeben werden, als die Expression der Transposase durch den Mais Ubiquitin-Promotor. Greco et al. (2001) konnten demonstrieren, dass die Präsenz eines doppelten enhancer-Elements des CaMV 35S-Promotors in der Nähe des Ac-Transposase-Promotors eine sehr frühe Exzision von Ac, direkt nach der Transformation in die Pflanzenzelle, induziert. Ähnliches wurde auch in Arabidopsis (Balcells and Coupland 1994, Honma et al. 1993, Smith et al. 1996) und Tabak (Keller et al. 1993) beobachtet. Späte Transpositionen und somit Nachkommen mit unabhängigen Transpositionen konnten in Arabidopsis, Tomate und Gerste beobachtet werden, wenn die Wildtyp Ac-Transposase eingesetzt wurde (Bancroft und Dean 1993, Rommens et al. 1993, Koprek et al. 2001).

Kolesnik et al. 2004 haben in ihrem Zweikomponenten-gene trap-System in Reis die Ac-Transposase unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors eingesetzt und haben Hinweise darauf, dass Ds spät in der Reisentwicklung transponiert.

In der GT-F2-Population konnte eine hohe Zahl an unabhängigen Transpositionen von GTDsB detektiert werden. In 49 der insgesamt 79 Pflanzen mit Transposition sind die Transpositionsereignisse unabhängig (Tab. 6). Bei diesen Transpositionen kann es sich um Ereignisse handeln, die zu einem sehr späten Zeitpunkt in der F1-Generation, in den Keimbahn-kompetenten Zellen, oder zu einem frühen Zeitpunkt in der F2-Generation stattgefunden haben. In den Nachkommen der F1-Linien GT73 und GT82 konnte jeweils in allen 4 bzw. 3 Pflanzen Transposition von GTDsB, die auf einem einzigen Transpositionsereignis beruht, detektiert werden (Tab. 6). Das ist der Hinweis auf eine Transposition des GTDsB-Konstrukts zu einem frühen Zeitpunkt in der Entwicklung der F1-Pflanze. In den Nachkommen der Linien GT32, GT29, GT41, GT49, GT54, GT38, GT19, GT40, GT13, GT80 konnten Transpositionsereignisse, die an mehrere, aber nicht an alle, Nachkommen vererbt wurden, detektiert werden (Tab. 6). Zum Beispiel konnte in allen vier Nachkommen der Linie GT40 Transposition von GTDsB detektiert werden. Dabei wurde in den Southernblotanalysen in jeweils zwei Nachkommen das gleiche Hybridisierungsmuster identifiziert, was auf insgesamt zwei unabhängige Transpositionen des GTDsB-Konstrukts hinweist (Daten nicht gezeigt). Da die Körner zur Herstellung der Nachkommen, mit Ausnahme von GT80, jeweils von einer Ähre der GT-F1-Pflanzen geerntet wurden, muss die Transposition in einem Sektor der Ähre und zu einem Zeitpunkt der Entwicklung stattgefunden haben, der zur Vererbung des Transpositionsereignisses an mehreren, aber nicht allen Nachkommen führt. Als weitere Erklärungsansätze sind Sekundärtranspositionen und die Segregation von GTDsB-Insertionen denkbar. Segregation ist z. B für die Nachkommen der beiden F1-Linien GT19 und GT13, in denen jeweils in drei von vier analysierten Nachkommen ein unabhängiges Transpositionsereignis detektiert wurde, vorstellbar. Eine Voraussetzung dafür wäre angesichts der geringen Zahl an analysierten Nachkommen eine

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ungekoppelte Transposition des GTDsB-Konstrukts. Koprek et al. (2000) haben in Gerste gezeigt, dass von transponierten Ds-Elementen 75% in gekoppelte und 25% in ungekoppelte chromosomale Regionen des Genoms reintegriert sind. Für das Ac-Element wurde gezeigt, dass es in Mais sowie in einigen heterologen Pflanzen wie Tabak und Arabidopsis mit einer hohen Frequenz in Positionen, die sich in enger Nachbarschaft zu den Donorstellen befinden, integriert (zur Übersicht Kunze 1996). In Zusammenhang mit Sekundärtranspositionen sind die Linien GT38, GT40 und GT41 interessant. In diesen konnte jeweils in allen Nachkommen mit Ausnahme von einer das gleiche Transpositionsereignis, also jeweils zwei unabhängige Transpositionsereignisse detektiert werden (Tab. 6). So ein Muster kann auf eine Primärtransposition des GTDsB-Konstrukts in der GT-F1-Generation und einer anschließenden Sekundärtransposition des transponierten GTDsB-Konstrukts in einer GT-F2-Pflanze zurückzuführen sein. Die hohe Zahl an unabhängigen Transpositionen verspricht eine effiziente Weitergabe an unabhängigen GTDsB-Integrationen im Rahmen einer gene trap-Population.