Fluoreszenzmessungen

Natriumphosphatpuffer; pH = 7.1) zwischen dem Hexadecamer und einem kleinen Protein steigern ließ. Interessant wäre ein Vergleich mit Bindungsaffinitäten zu anderen Proteinen mit der Frage, ob eine selektive Erkennung bzw. eine Unterscheidung von bestimmten Proteinen möglich ist. Dies soll im folgenden Kapitel näher untersucht werden.

Mit dieser Methode wurden verschiedene Proteine markiert, um ihre Affinitäten zu den Dendrimeren zu testen. Zum direkten Vergleich mit den UV/Vis-Messungen wurde auch das dort verwendete Cytochrom c fluoreszenzmarkiert.

Da der OregonGreen Succinimidylester aufgrund der verschiedenen Zugänglichkeit des N-Terminus unterschiedlich leicht mit den Proteinen reagiert, muß zunächst getestet werden, wie gut die Proteine gelabelt wurden. Der Fluoreszenzmarker absorbiert normalerweise bei 496 nm und emittiert bei 535 nm. Dies variiert allerdings von Protein zu Protein und ist wahrscheinlich abhängig von der chemischen Umgebung des N-Terminus. Vergleicht man die Absorption einer 1 mg/mL konzentrierten Lösung des gelabelten Proteins bei 280 nm (Absorption des Proteins) mit der Absorption am Maximum des Fluoreszenzmarkers, so kann über die Gleichung 4 der Markierungsgrad des Proteins bestimmt werden.

[

]

MG ⋅ε

= ⋅

Gleichung 4: zur Bestimmung des Markierungsgrades MG über die Absorption des OregonGreen 488 Amax, dem Molekülgewicht des gelabelten Proteins MW, der Konzentration des Proteins [Protein] und dem Extinktionskoeffizienten des Fluoreszenzmarkers ε_Marker = 70000 cm^-1M^-1.

Die Markierungsgrade sind in Tabelle 4 aufgeführt. Sie bewegen sich alle im Bereich von 20 – 50%. Dies bedeutet, daß etwa jedes zweite bis fünfte Protein gelabelt wurde. Der eigentliche Markierungsgrad sollte keinen großen Einfluß auf die Fluoreszenztitration haben.

Allein die Intensität eines Effektes hängt von dem Anteil der markierten Proteine ab. Dies setzt natürlich voraus, daß der Fluoreszenzmarker keinen Einfluß auf die Bindung hat und gelabelte und ungelabelte Proteine dieselbe Assoziationskonstante im Komplex mit dem Dendrimer besitzen.

Tabelle 4: Übersicht über die mit OregonGreen^TM 488 markierten Proteine

Protein pI Masse Markierungsgrad Konzentration

BSA 5.8 66 kDa 32 % 1.198⋅10^-4 mol/L

Proteinase K 8.1 29 kDa 12 % 3.160⋅10^-5 mol/L Cytochrom c 9.6 12 kDa 20 % 7.363⋅10^-4 mol/L Histon H1 10.5 8 kDa 48 % 6.777⋅10^-4 mol/L Lysozym 9.1 14 kDa bei Markierung denaturiert Chymotrypsin 8.2 26 kDa 36 % 3.126⋅10^-4 mol/L Lysozym denaturierte bei den Markierungsbedingungen und fiel im Verlauf der Reaktion aus.

Dasselbe Problem trat auch bei dem Histon H1 auf, jedoch konnte es unter Verwendung einer geringeren Konzentration an Markierungsfarbstoff umgangen werden (nur 4facher Überschuß, auf die Hälfte verdünnt).

Die Fluoreszenztitrationen wurden sowohl mit dem Tetramer als auch mit dem Octamer in 10 mM Phosphatpuffer bei pH = 7.1 durchgeführt. Sowohl das unmarkierte Protein, als auch das Dendrimer zeigten keinerlei Absorption oder Emission in dem beobachteten Wellenlängenbereich. Es wurde beobachtet, daß die Fluoreszenzemission stark temperaturabhängig ist, so daß die Fluoreszenzmesszelle permanent temperiert werden mußte.

Auch ein Rühren der Lösung erzeugte stabilere Meßergebnisse, die ansonsten starken Schwankungen unterworfen waren. Bei allen untersuchten Proteinen trat im Verlauf der Titration ein Anstieg der Emissionsintensität des Fluoreszenzmarkers auf. Die Effekte bei Chymotrypsin und Proteinase K waren jedoch zu gering, um daraus eine Aussage über eine eventuelle Bindung abzuleiten. Wahrscheinlich ist der Abstand der Bindungsstelle des Dendrimers von dem markierten N-Terminus der entscheidende Faktor für die Stärke des Effekts. Abbildung 45 zeigt am Beispiel des Cytochrom c den Abstand des Fluoreszenzlabels von dem aktiven Zentrum des Proteins, an dem wahrscheinlich das Dendrimer bindet.

Abbildung 45: links: Schematische Darstellung des OregonGreen^TM 488 (in grün) markierten Cytochrom c im Komplex mit dem Octamer Tetrakis-[bis(3,5-bis(methoxyphosphonylmethyl)benzylaminopropyl-1,3-diaminopropyl)]-1,4-diaminobutan Hexadecalithiumsalz 29 (gelb). rechts: Beispiel einer Schar von Fluoreszenzemissionsspektren im Verlauf einer Titration. Ein deutlicher Anstieg der Emission um etwa 30 % ist zu beobachten.

Trotz dieses großen Abstandes ist ein deutlicher Anstieg der Emissionsintensität bei allen untersuchten Proteinen (außer Proteinase K und Chymotrypsin) zu beobachten gewesen.

Wahrscheinlich bedingt die Komplexierung des Bisphosphonats in einigen Fällen wieder eine Konformationsänderung des Proteins und damit eine Änderung der näheren chemischen Umgebung um den Fluoreszenzmarker. Bei allen Messungen strebt der Anstieg der Emission asymptotisch gegen ein Maximum. Die quantitative Auswertung erfolgte mit demselben Verfahren, wie bei NMR-Shift-Titrationen. Bei der Bestimmung der Stöchiometrie ergaben sich dieselben Probleme wie bei der UV/Vis-Titration. Normalerweise wird bei der

Bestimmung der Komplexstöchiometrie eine Titration mit konstanter Gesamtkonzentration beider Bindungspartner durchgeführt (Job-Plot). Dafür ist es jedoch notwendig, die Konzentration des fluoreszierenden Proteins stark zu variieren. Da diese Variationen eine starke Änderung in den Emissionsspektren hervorrufen, überlagern diese Effekte den im Gegensatz dazu schwachen Effekt der Komplexbildung. Deshalb wurden wie schon bei den UV/Vis-Titrationen die Stöchiometrien aus den Titrationen direkt abgeleitet. Diese abgeleiteten Stöchiometrien geben jedoch nur Hinweise auf die tatsächlich vorliegenden Verhältnisse. Aufgrund dieser Tatsache wurden jeweils obere und untere Grenzen für die Stöchiometrie angegeben, zwischen denen sich die tatsächliche Stöchiometrie bewegen wird.

Höhere Stöchiometrien (z.B. 2:4 statt 1:2) oder gemischte Stöchiometrien (z.B. 2.5:1) können bei der Anzahl der flexiblen Bindungsstellen nicht ausgeschlossen werden.

Tabelle 5 faßt die Messungen aus den Fluoreszenztitrationen zusammen.

Tabelle 5: Fluoreszenztitrationsergebnisse (in Klammern die ermittelten Stöchiometrien) Protein Tetramer Octamer Cytochrome c 2100 M^-1 (2:1) 4900 M^-1 (2:1)

BSA 3100 M^-1 (3:1-4:1) 19700 M^-1 (2:1-3:1) Chymotrypsin Effekte zu klein Effekte zu klein

Histon H1 1100 M^-1 (2:1-3:1) nicht gemessen Proteinase K kein Effekt kein Effekt

In den meisten Fällen ergibt sich eine Komplexstöchiometrie von 2:1, nur bei BSA sind auch höhere Stöchiometrien von 3:1 oder 4:1 möglich. Dieselbe Tendenz, die auch schon bei den UV/Vis-Titrationen zu sehen war, wird hier ebenfalls deutlich: Das Octamer bindet die entsprechenden Proteine jeweils um den Faktor 2 bis 6 besser als das Tetramer. Eine deutliche Unterscheidung der Proteine anhand des pI-Wertes ist nicht zu beobachten; betrachtet man die Struktur des BSA genauer, so wird jedoch deutlich, daß trotz des niedrigen pI-Wertes und des daher schwach sauren Charakters des Proteins die sauren Aminosäuren wie Asparaginsäure und Glutaminsäure in konkreten Domänen an der Oberfläche konzentriert sind. Ebenso gibt es deutlich basische Domänen, an die die Dendrimere binden können. Die Bindungsstärke ist also weniger vom allgemeinen sauren oder basischen Charakter des Proteins abhängig, sondern vielmehr von der Anzahl und Dichte der basischen Domänen.

Daher ist das größte Protein mit immerhin mehr als 60 basischen Aminosäuren an der Oberfläche (BSA) auch der stärkste Bindungspartner für die Liganden. Das Histon H1 als basischstes Protein wird aufgrund seiner geringen Größe und damit geringen Anzahl an basischen Gruppen am schwächsten gebunden.