Fluoreszenz-Mikroskopie

Färbung von Kryo-Kochlea-Schnitten

In dieser Arbeit wurde die indirekte fluorophor-gekoppelte Immunfärbung angewendet.

Um unspezifische Bindungen der nachzuweisenden Antikörper zu unterbinden, versucht man, die Klebrigkeit von Proteinen vorher durch andere Proteine mittels Blocken abzusättigen. Im Blocker sind neben Serumproteinen auch Antikörper vorhanden, die an Antigene im Gewebe-schnitt binden könnten. Häufig eingesetzte Blocker sind Milchpulver, Gelatine, Albumin oder Normalserum. Der optimale Blocker muss für jede Antikörper-Applikation getestet werden. In dieser Arbeit wurde folgende Blocker-Lösung verwendet: 1 % BSA in 1x PBS. Diese wurde 1 h bei RT unter sanftem Schwenken mit den Gewebepräparaten inkubiert. Danach erfolgte die Übernacht-Inkubation der Schnitte mit den Primär-Antikörper-Verdünnungen (2.3.1) in 0,5 % BSA in 1x PBS bei 4°:

 αPres (aus Ziege) 1:800

 αCav-1 (aus Kaninchen) 1:400

Daraufhin wurden die Schnitte für dreimal 10 min in 1x PBS gewaschen und für 1 h bei RT mit dem Sekundär-Antikörper (2.3.1) 0,5 % BSA in 1x PBS inkubiert. Diesen Lösungen wurde zur Darstellung der Zellkerne 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI, in PBS gelöst) in einer Verdün-nung von 1: 5000 zugesetzt.

 αZiege Alexa-Fluor 568 (gegen Pres-Antikörper) 1:200

 αKaninchen Alexa-Fluor 488 (gegen Cav-1-Antikörper) 1:200

Die Kochlea-Schnitte wusch man unter sanftem Schwenken zweimal für 10 min in 1x PBS und einmal in PB bei RT.

PB (phosphate buffer 240 mM): ad 1 Liter H2O

 Na2HPO 427,52 g

 NaH2PO4 5,52 g

Die Präparate konnten direkt für die Visualisierung am Konfokal-Mikroskop verwendet oder in Mowiol-Medium (0713, Roth) für die Aufbewahrung eingebettet werden.

Elektronen sich nicht lange auf diesem Niveau halten können, fallen sie auf ihr ursprüngliches Energie-Niveau zurück und setzen dabei Energie frei. Ein Teil der Energie wird als Fluoreszenz emittiert.

2.4.1 Ground State Depletion followed by Individual Molecule Return (GSdim)-Mikroskopie

Die GSdim-Technologie ist eine super hoch auflösende Nanoskopie jenseits der klassischen Auflösungsgrenze basierend auf der Lokalisation von fluoreszierenden Einzelmolekülen. Die Fluorophore zuerst müssen vorübergehend getrennt werden, um eine präzise Detektion der Ein-zelmoleküle zu bewirken: Dafür werden die Fluorophore mittels hoher Lichtintensitäten (i.d.R.

ein Hochenergie-Laser) temporär in einen nicht-fluoreszierenden Dunkel-off-Zustand transfe-riert, von wo aus die Einzelmoleküle zufällig in den Grundzustand zurückkehren. Während die-ser Rückkehr emittieren die Moleküle Photonen (das sogenannte Blinken im on-Zustand), die eingefangen und detektiert werden. Aus mehreren tausend Einzelaufnahmen werden die Positi-onsinformationen aller Fluorophore gesammelt. Über einen Software-Algorithmus (Jedes Blin-ken wird lokalisiert. Die Schwerpunkt-Koordinaten werden mittels Anpassung der Point-Spread-Funktion (PSF) an eine Gaußsche Funktion ermittelt.) können daraus die Koordinaten der einzelnen Fluorophore bestimmt und als super hoch auflösendes Bild rekonstruiert werden.

Je mehr Schwerpunkt-Koordinaten eines Fluorophors überlappen, desto stärker erscheinen die Signale im Bild und entsprechen der realen Position des Moleküls. Eine laterale Auflösung von bis zu 20 nm ist mit dieser Technologie erreichbar, dabei ist die Auflösung von den Eigenschaf-ten des Fluorophors und vom Einbett-Medium abhängig.

Es wurde mit einem Leica SR GSD Widefield Superresolution Mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar) der Bioimaging Facility des SFB 593 der Universität Marburg gearbeitet. Bei dem Mikroskop handelte es sich um ein DMI 6000 B TIRF mit einer Andor iXon DU-897 EM CCD-Kamera und einem HCX PL APO 100.0x1.47 OIL-Objektiv. Das System war mit diesen Lasern ausgestattet:

 488 nm solid-state laser (300 mW)

 532 nm solid-state laser (500 mW)

 642 nm solid-state laser (500 mW)

 405 nm solid-state laser (30 mW)

Zur Aufnahme und Analyse der Bilder wurde die Software LAS AF von Leica Microsystems genutzt (Fölling et al. 2008; http://www.leica-microsystems.com/science-lab/step-by-step-guide-to-the-molecular-basics-of-gsdim-microscopy). Der 488 nm-Laser wurde mit einer Intensität von 5 Einheiten eingesetzt, der gain betrug 5.0, der EM gain 300 units. Die Expositionszeit der

rPres-YFP und 3353 Einzelaufnahmen in 35,615 sec von zPres-YFP aufgenommen (i.d.R. zwi-schen 2000 und 15000 Einzelaufnahmen).

Um die Wahrscheinlichkeit der Fluorophore zu höhen, einen möglichst langlebigen off-Zustand zu erreichen, erfolgte die Einbettung der Probe unter reduzierenden Bedingungen in einem Spe-zialmedium nach den Angaben des Herstellers. Für die Verwendung von YFP-markierten Kon-strukten (als Fusionsprotein) wurde ein PBS-Puffer (pH 7.4) mit folgenden Endkonzentrationen optimiert:

 Katalase (Sigma C1345) 40 µg/ ml

 Glukose-Oxidase (Sigma G2133) 0,5 mg/ ml

 Glukose (Roth 6780.1) 10 mM

 β-Mercaptoethylamin (MEA = Cysteamin, Sigma 30070-10G) 1 mM

Die Zellen ließ man auf Standard-Deckgläschen (Ø 18 mm, P 233.1, Roth) bis 60 % Konfluenz wachsen und transfizierte sie mit den YFP-markierten Pres-Konstrukten. 48 h später wurden sie mit PFA bei RT fixiert (siehe 2.1.7) und für die GSdim-Mikroskopie genutzt.

2.4.2 Totale Interne Reflexions-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Die Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy ist eine Methode der Licht-Mikroskopie, die ein evaneszentes Lichtfeld (auch Anregungsfeld genannt) nutzt, um selektiv Fluorophore an der Grenzschicht vom Präparat zum Glas anzuregen. Die Erzeugung dieses eva-neszenten Feldes basiert auf der Totalreflexion des flach einfallenden Lichtstrahls an dieser Grenzschicht (von einem Medium mit höherem Brechungsindex zu einem Medium mit niedri-gerem Brechungsindex) und erreicht maximal 200 nm. Die Intensität des evaneszenten Feldes fällt mit wachsendem Abstand von der Grenzfläche exponentiell ab. Befinden sich in diesem Feld Fluoreszenz-Moleküle, die das Licht der eingestrahlten Wellenlänge absorbieren können, so werden sie zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Der Vorteil der TIRFM liegt im geringen Signal-Rausch-Verhältnis in der Fokusebene, welches durch die vollständige Unter-drückung der Fluoreszenzanregung außerhalb dieses Feldes bewirkt wird. Man ist aber auf diese Ebene an der Grenzschicht zwischen Glas und Flüssigkeit festgelegt. Damit ermöglicht die TIRFM die selektive Visualisierung der grenzschicht-nahen Bereiche wie der Plasmamembran und eng angrenzender zytoplasmatischer Regionen.

Das in dieser Arbeit genutzte TIRF-Mikroskop vom Modell Leica DMI 6000 B wurde durch die Bioimaging Facility des SFB 593 der Universität Marburg zur Verfügung gestellt. Für die Auf-nahme der Bilder wurde ein TIRF-100x-Öl-Objektiv (HCX PL APO 100.0x1.47 OIL) eingesetzt mit einer DFC350FXR2-095583305-Kamera. Die Software LAS AF des Herstellers Leica Mic-rosystems wurde verwendet. Es wurde mit Laser-Intensitäten zwischen 3 und 5 Einheiten

gear-beitet, die Expositionszeit lag i.d.R. zwischen 500 und 1500 msec, der gain wurde auf 10.0 Units eingestellt. Für YFP (für rPres-YFP und zPres-YFP) und RFP- (für cPres-RFP) spezifi-sche Standard-Filter-Einstellungen wurden nach Herstellervorschlägen genutzt. Das Mikroskop war mit 4 verschiedenen Dioden-Lasern ausgestattet:

 405 nm

 488 nm

 561 nm

 633 nm

Die Zellen ließ man auf Glasboden-Schälchen (HBSt-5040, WillCo Wells) bis 60 % Konfluenz wachsen und transfizierte sie mit Fluoreszenz-Fusionsprotein-Konstrukten. 48 h später wurden sie mit PFA (siehe 2.1.7) bei RT fixiert und visualisiert.

2.4.3 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)

Die Confocal Laser Scanning Microscopy, auch Konfokal-Mikroskopie genannt, zeichnet sich dadurch aus, dass nicht das gesamte Präparat beleuchtet wird, sondern zu jedem Zeitpunkt nur ein Bruchteil des abzubildenden Bereiches von einem fokussierten Lichtpunkt abgetastet (abgescannt) wird. Dabei entsteht im Mikroskop selbst zu keinem Zeitpunkt ein vollständiges Bild, dieses wird erst mit Hilfe einer Software rekonstruiert. Die Fluoreszenz wird immer nur an einer Stelle angeregt und somit die Entstehung von Streulicht im Umfeld minimiert. Man unter-scheidet die hier genutzte punktscannende konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie von der Nipkow-Rotations-Scheiben-Mikroskopie, wo mehrere Lochblenden spiralförmig angeordnet sind. Bei allen Konfokal-Mikroskopen gibt es vor dem Detektor, in der hinteren Brenn-Ebene, eine zusätzliche Lochblende, das sogenannte pinhole. Dieses blendet das Licht von außerhalb der Objektebene aus, so dass nur Licht aus dem scharf abgebildeten Bereich durchgelassen wird. Durch diesen Aufbau kann nur das Licht aus der Objekt-Ebene den Detektor erreichen.

Dies ermöglicht eine hochgradige Kontrast-Erzeugung.

Die konfokalen Aufnahmen wurden mit einem LSM 710 AXIO Examiner Z1-Mikroskop der Firma Zeiss mit ZEN-Software (2009) und folgender Ausstattung genutzt:

Laser:

 DPSS 561-10 (561 nm)

 Argon-Multiline 25 mW (458, 488, 514 nm )

 He/ Ne633 (633 nm)

 Diode laser 405-30 (405 nm)

Filter:

 47 CFP Exzitation 436/ 20 Emission 480/ 40

 38 endow GFP Exzitation 470/ 40 Emission 525/ 50

 46 YFP Exzitation 500/ 20 Emission 535/ 30

 63 HE mRFP Exzitation 572/ 25 Emission 620/ 62

Objektive:

 W Plan Apochromat 20 x / 1,0 DIC M27 75 mm

 W Plan Apochromat 63 x / 1,0 M27

Die Zellen ließ man auf Coverslips (Ø 12 mm, Roth P231.2) bis 60 % Konfluenz wachsen und transfizierte sie mit den gewünschten Fluoreszenz-Konstrukten. 24 h, 48 h oder 72 h nach der Transfektion wurden sie bei einer Standard-Einstellung von 2 bis 15 %-Laser-Intensität, einem Verstärkungsfaktor von ≤ 800 und einem pine hole von 1 AU konfokal visualisiert und analy-siert. Wenn keine Angabe der Zeit der Aufnahmen angegeben wurde, so erfolgte die Konfokal-Aufzeichnung 36 bis 48 h nach der Transfektion.

Applikationen und Prä-Inkubationen/ Temperatur-Modifikationen

Die Applikation von LatA (2.1.10) erfolgte über ein eigens hergestelltes Applikationssystem bestehend aus einer Applikationsspitze (Microfil 28 AWG, MF28G67-5, World Precision In-struments), die über Fein-Schläuche (Fine Bore Polythene Tubing 0,28 mm ID, 0,61 mmOD, 800/100/100, Smith Medical ASD) mit einem 10 ml-Reservoir (Omnifix 10 ml/ Luer Lock Solo, 4617100V, Braun) für die Applikationslösung verbunden war und über einen Mikromanipulator (Display SM-5 Remote Control System 877-T0821, Luigs & Neumann) gesteuert wurde. Zusätz-lich erfolgte eine Perfusion mit Ex-0 über ein Zuleitungs-Abpump-System (Infusionsgerät Air G, 74.4101, Sarstedt; Rotilabo-Silikonschlauch Ø innen: 1 mm, Ø außen 3 mm, 9556.1, Roth).

Diese Systeme wurden über 3-Wege-Hähne (74.4410.001, Sarstedt) kontrolliert. Über einen derartigen Aufbau erfolgte auch die Applikation der Ex-0-Lösungen mit den verschiedenen pH-Werten (6,5 und 8,5).

Die Prä-Inkubation mit Zytochalasin D (2.1.9), Kolchizin (2.1.11) β-Methyl-Zyklodextrin (2.1.13) sind in den indizierten Abschnitten nachzulesen.

Die Temperaturmodifikationen der Pres-transfizierten Zellen erfolgten über einen Mikro-Inkubator mit Peltier-Element. Die Coverslips mit den Zellen wurden zügig aus dem Zellkultur-Inkubator in die vorgewärmten 37° C-warmen Lösungen des Mikro-Zellkultur-Inkubators umgesetzt. Nach 10-minütiger Inkubationszeit wurde das GFP-Fluoreszenzsignal aufgezeichnet. Anschließend wurde die Temperatur auf 22° C eingestellt, erneut 10 min inkubiert und anschließend die Fluo-reszenz aufgezeichnet. Nun wurde die Temperatur zurück auf 37° C gestellt. Nach 10 min

bationszeit zeichnete man die Fluoreszenz nochmals auf. Für diesen Schritt wurden auch Inku-bationszeiten bis zu 2 h getestet. Über ein Perfusionssystem (Infusionsgerät Air G, 74.4101, Sarstedt; Rotilabo-Silikonschlauch Ø innen: 1 mm, Ø außen 3 mm, 9556.1, Roth) wurden die Zellen mit Extrazellulär-Lösung bzw. CHO-Nährmedium umspült.