Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine auf Fluoreszenzfarbstoffen basierende Nachweismethode zur Lokalisation definierter DNA- oder RNA-Sequenzen, die mit komplementären DNA- bzw. RNA-Abschnitten auf Chromosomen oder Gewebeschnitten unter geeigneten Bedingungen hybridisieren.

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung wurde am Max-Planck-Institute für Molekulare Genetik in Berlin in Zusammenarbeit mit Frank Grützner aus der Arbeitsgruppe von Thomas Haaf durchgeführt.

2.2.21.1 Chromosomenpräparation

Für die Präparation von Fugu rubripes rubripes Metaphase-Chromosomen wurde eine Fibroblasten-Zelllinie eingesetzt (Bradford et al., 1997).

Vor der Chromosomenpräparation wurde das Kulturmedium mit 0,1 µg/ml Colchicin versetzt und für weitere vier Stunden inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit PBS gewaschen, nach Zugabe einer Trypsininlösung durch vorsichtiges Klopfen gelöst und in ein Zellkulturröhrchen überführt. Durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min wurde der Überstand abgenommen und die Zellen in einer hypotonen Lösung (50 mM KCl) für 20 min inkubiert. Nach erneuter Sedimentation wurde diese Lösung durch eine Fixierlösung ersetzt (3:1 Methanol/Eisessig) und über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen auf entfettete Objektträger aufgetropft.

2.2.21.2 Markierung der DNA-Sonde mit Biotin-16-dUTP bzw. Digoxiginin-11-dUTP

Die DNA-Sonden wurden mittels Nick-Translation (Rigby et al., 1977) behandelt.

Das Enzym DNaseI fügt bei geringer Konzentration und in Anwesenheit von Mg²⁺ -Ionen statistisch verteilte Einzelstrangbrüche („Nicks“) in zirkuläre oder lineare DNA-Substrate ein. An diesen Stellen setzt die 5´→3´-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase an und baut einzelne Nukleotide in 3´-Richtung ab. Die so entstandenen Lücken werden durch die Polymerase-Aktivität des Enzyms wieder geschlossen. Es werden am 3´-OH der Desoxyribose komplementäre Nukleotide eingebaut. Dem Enzym werden radioaktiv markierte oder chemisch modifizierte Desoxynukleotide als Substrat angeboten. Auf diese Weise werden die neu synthetisierten Stränge markiert.

Als modifiziertes Desoxyribonukleosid-Triphosphat wurde Biotin-16-dUTP bzw.

Digoxigenin-11-dUTP zu der Reaktion gegeben.

2.2.21.3 Vorbehandlung der Chromosomenpräparate

Die Chromosomenpräparate wurden 5-10 min in 2 x SSC äquilibriert und anschließend einer RNase Behandlung unterzogen, um so eine Hybridisierung von DNA-Sonden mit RNA-Molekülen, die sich auf dem Objektträger befinden, zu vermeiden. Dazu wurde die RNase A-Lösung (10 mg/ml) in 2 x SSC 1:100 verdünnt.

Es wurden 100 µl dieser Lösung auf die Objektträger aufgetropft, diese mit einem Deckglas abgedeckt und für 1 h bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Präparate wurden 3 x 5 min in 2 x SSC gewaschen. Anschließend erfolgte mittels Pepsinverdau die Entfernung von Proteinen, die die Chromosomen umgeben. Der Pepsinverdau sowie die folgenden Waschschritte wurden in Glasküvetten mit einem Volumen von 50 ml unter Schütteln durchgeführt. Die Objektträger wurden für 10 min in einer 50 µg Pepsin / 0,01 N HCl (w/v) Lösung mit pH 2,3 inkubiert.

Nachfolgend wurden sie 2 x 5 min in 1 x PBS und 1 x 5 min in 1 x PBS / 50 mM MgCl2 gewaschen und 10 min in 1 % Formaldehyd /1 x PBS / 50 mM MgCl2 fixiert.

Die Präparate wurden 5 min in 1 x PBS gewaschen, in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 80 % und 100 % Ethanol) dehydriert und luftgetrocknet.

2.2.21.4 Denaturierung chromosomaler DNA

Die Denaturierung der Chromosomenpräparate erfolgte für 1 min bei 90°C in 70 % (v/v) Formamid / 2 x SSC. Um die vorzeitige Renaturierung der chromosomalen DNA zu verhindern, wurden die Objektträger in einer eisgekühlten, aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 80 % und 100 % Ethanol) je 3 min dehydriert und anschließend luftgetrocknet.

2.2.21.4.1 Vorbereitung der Proben-DNA

Bei der FISH mit PAC-DNA-Sonden, die repetitive Sequenzen enthalten, wurden die Bedingungen der chromosomalen in situ Suppression (CISS)-Hybridisierung eingehalten. Die repetitiven DNA-Abschnitte der Sonde wurden vor der Hybridisierung mit Kompetitor-DNA präassoziiert (Sealey et al., 1985; Landegent et al., 1987; Lichter et al., 1988; Lengauer et al., 1990). Grundlage dieser Vorbehandlung ist, dass denaturierte DNA-Stränge zuerst mit ihren im Überschuss vorhandenen repetitiven Anteilen renaturieren. Durch die Absättigung repetitiver DNA-Sequenzen werden Kreuzhybridisierungen verhindert und somit unspezifische

Bei den verwendeten PAC-Sonden diente genomische DNA des Kugelfischs Fugu rubripes rubripes und gescherte humane Placenta DNA als Kompetitor-DNA.

2.2.21.5 Hybridisierung und Detektion

Für das Hybridisierungsgemisch wurden 400 ng markierte Proben-DNA (Biotin und/oder Digoxigenin) mit 1 - 5 µg gescherter genomischer Fugu-DNA und 10 – 20 µg gescherter menschlicher Placenta-DNA kopräzipitiert. Der Ansatz wurde in 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat und 2 x SSC gelöst und für 10 min bei 80°C denaturiert. Zum Preannealing der repetitiven Sequenzen wurde der Hybridisierungsansatz bei 37°C für 30 min inkubiert.

Anschließend wurde das Hybridisierungsgemisch auf die denaturierten Präparate gegeben und diese mit einem Deckglas blasenfrei abgedeckt. Zum Schutz vor Austrocknung wurden die Präparate mit Fixogum versiegelt (Marabuwerke, Tamm).

Die Hybridisierung erfolgte für drei Tage bei 37°C in einer feuchten Kammer.

Nach der Hybridisierung wurden die Deckgläser vorsichtig von den Objektträgern genommen. Zum Entfernen überschüssiger oder unspezifisch gebundener Sonden wurden die Präparate 3 x 5 min in 50 % (v/v) Formamid / 1 x SSC bei 45°C und einmal 5 min in 0,1 x SSC bei 60°C gewaschen. Anschließend kühlte man die Objektträger auf Raumtemperatur in 4 x SSC / 0,1 % (v/v) Tween 20 ab.

Zur Vermeidung unspezifischer DNA/Protein- bzw. Protein/Protein-Wechselwirkungen erfolgte eine Absättigung freier Bindungsstellen mit 4 x SSC / 0,1 % Tween-20(v/v) /3 % BSA(w/v) für 30 min bei 37°C in einer feuchten Kammer.

Die biotinylierte DNA-Sonden wurden mit dem an Avidin gekoppelten Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) nachgewiesen. Avidin ist ein aus Hühnereiweiß isoliertes Glykoprotein mit einer sehr hohen Bindungsaffinität zu Biotin.

Zur Herstellung der Gebrauchslösung wurden FITC-Avidin (Stammlösung:

2,0 mg/ml) und ein biotinylierter Anti-Avidin Antikörper (0,5 mg/ml) jeweils 1:200 in 4 x SSC / 0,1 % Tween-20 (v/v) / 3 % BSA (w/v) verdünnt. Auf jeden Objektträger wurden 20 µl FITC-Avidin Gebrauchslösung aufgetropft, mit einem Deckglas abgedeckt und für 30 min bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.

Nach den anschließenden Waschschritten, 3 x 5 min in 4 x SSC / 0,1 % Tween-20 (v/v) bei 45°C, wurde eine Verstärkerreaktion durchgeführt. Hierzu kam ein

gegen Avidin gerichteter biotinylierter Antikörper aus Kaninchen zum Einsatz. Es wurden 20 µl Biotin-Anti-Avidin-Gebrauchslösung aufgetropft, ein Deckglas blasenfrei aufgelegt und für 45 min bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.

Der nachfolgende Biotin-Nachweis mit FITC-Avidin und die anschließenden Waschschritte erfolgten wie oben beschrieben. Diese Art der Verstärkung von Fluoreszenz-Signalen wird als „Sandwich-Technik“ bezeichnet.

Nach dem letzten Waschschritt wurden die Präparate durch 4,6 Diamidin-2-Phenylindol (DAPI) gegengefärbt. Dieser Farbstoff lagert sich interkalierend in die Doppelhelix der DNA ein. Für die mikroskopischen Auswertungen an einem Fluoreszenzmikroskop wurden die Präparate mit Vectashield (Vysis) eingedeckt 2.2.21.6 Auswertung und Dokumentation der FISH-Ergebnisse

Die Lokalisation einer DNA-Sonde gilt als eindeutig, wenn in mindestens 20 Metaphasen Signale auf beiden homologen Chromosomen und jeweils ein Signal auf jeder Chromatide zu sehen sind. Um die Hybridisierungssignale einem bestimmten chromosomalen Bereich zuzuordnen, wurden die Fluoreszenzaufnahmen mit einem DAPI-Filter und einem FITC-Filter durchgeführt. Diese Bilder wurden übereinandergelegt und entsprechend eingefärbt.

Zur mikroskopischen Auswertung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung stand ein ZEISS Axioplan Mikroskop mit Epifluoreszenzeinrichtung und gekühltem CCD-Kameraaufsatz zur Verfügung. Die computergesteuerte Bildauswertung der mit der hochauflösenden Kamera aufgenommenen Graustufenbilder erfolgte an einem Macintosh Power PC 801 mit hochauflösendem Monitor unter der Verwendung der Software Quips-FISH der Firma Vysis. Der Einsatz dieser Analyseverfahren ermöglicht eine kontrastreiche Darstellung von Bandenmustern und Signalen.