Ergebnisse 66
Abb. 3.18: gegenläufige AIF- und Smac-Expression in den Melanomzelllinien MeWo uns SK-Mel-13. Western-Blot-Analyse der proapoptotischen Proteine Smac und AIF. Untersucht wurde jeweils eine unbehandelte Kontrolle (K) sowie Zellen nach der Behandlung mit CH-11(gelb) und TNF-α (rot). Βeta-Aktin diente als Ladekontrolle.
Dargestellt wird jeweils ein repräsentativer Blot von 3 in gleicher Form reproduzierten Ergebnissen.
3.3 Expressionsanalyse von Regulatoren der Apoptose in der
Ergebnisse 67
Abb. 3.19: Keine Veränderung der Expression von XIAP und cIAP1 in SK-Mel-13 und deren Transfektanten nach Behandlung mit CH-11 (gelb), TNF-α (rot) oder Doxycyclin (blau). Western-Blot-Analyse für XIAP und cIAP1 in der Melanomzelllinie SK-Mel-13 und deren stabilen Transfektanten SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95L. Zum Vergleich wurden jeweils unbehandelte Zellen zur Kontrolle (K) aufgetragen. Der XIAP-Antikörper (250 μg IgG/ml) wurde in einer Verdünnung von 1:250, der cIAP1-Antikörper (200 μg IgG/ml) in einer Verdünnung von 1:200 verwendet. Βeta-Aktin diente als Ladekontrolle. Es wird je ein repräsentativer Blot von 3 in gleicher Form reproduzierten Ergebnissen abgebildet.
3.3.2 Gesteigerte cIAP2-Expression bei SK-Mel-13-Transfektanten
Nach stabiler Transfektion der Melanomzelllinie SK-Mel-13 (1 +/- 0,1) wurde im entstandenen Klon SK-Mel-13-Tet-On eine Steigerung der cIAP2-Expression nachgewiesen (2,3 +/- 0,5; p=0,03). Eine weitere Erhöhung der Expression zeigte sich nach Transfektion mit pTRE-CD95L im Klon SKM13-CD95L (4,9 +/- 1,4; p=0,02).
Ergebnisse 68
Durch die Inkubation der beiden Transfektanten mit Doxycyclin waren keine Veränderungen festzustellen (siehe Abb. 3.20).
Abb. 3.20: Gesteigerte cIAP2-Expression bei SK-Mel-13-Transfektanten. Oben: Western-Blot-Analyse von cIAP2 in der Melanomzelllinie SK-Mel-13 und den Transfektanten SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95L nach Behandlung mit CH-11 (gelb), TNF-α (rot) und Doxycyclin (blau). Zum Vergleich wurden jeweils unbehandelte Zellen zur Kontrolle (K) aufgetragen. Der cIAP2-Antikörper mit einer Konzentration von 200 μg IgG/ml wurde in einer Verdünnung von 1:200 verwendet. Βeta-Aktin diente als Ladekontrolle. Es wird je ein repräsentativer Blot von 3 in gleicher Form reproduzierten Ergebnissen abgebildet. Unten: Graphik zur optischen Darstellung der Expressionsstärke von cIAP2 in SK-Mel-13 und seinen Transfektanten. Dargestellt sind die Mittelwerte mit den dazu gehörigen Standardabweichungen.
Der Mittelwert von SK-Mel-13 wurde dem Wert 1 gleichgesetzt. Die Werte stammen aus der semiquantitativen Analyse der illumineszierenden Signale mit dem Programm TINA. Die sagital gestrichelten Linien dienen der optischen Trennung der Zelllinien.
3.3.3 Gesteigerte Survivin-Expression bei SK-Mel-13-Transfektanten
In den stabil transfizierten Klonen SK-Mel-13-Tet-On (rel. Expressionsfaktor 4,26; SD 1,4) und SKM13-CD95 (rel. Expressionsfaktor 7,36; SD 1,33) war auch eine Steigerung der Survivin-Expression im Vergleich zur Ursprungszelllinie SK-Mel-13 zu verzeichnen.
Ergebnisse 69
Die Expressionsstärke von Survivin veränderte sich jedoch durch die Behandlung mit CH-11 und TNF-α in SK-Mel-13 und in den entsprechenden Zellklonen nicht mehr (siehe Abb 3.21).
Abb. 3.21: Gesteigerte Survivin-Expression bei SK-Mel-13-Transfektanten. Oben: Western-Blot-Analyse von Survivin in der Melanomzelllinie SK-Mel-13 und den Transfektanten SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95L nach Behandlung mit CH-11 (gelb), TNF-α (rot) und Doxycyclin (blau). Zum Vergleich wurden jeweils unbehandelte Zellen zur Kontrolle (K) aufgetragen. Der Survivin-Antikörper mit einer Konzentration von 200 μg IgG/ml wurde in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Βeta-Aktin diente als Ladekontrolle. Es wird je ein repräsentativer Blot von 3 in gleicher Form reproduzierten Ergebnissen abgebildet. Unten: Graphik zur optischen Darstellung der Expressionsstärke von Survivin in SK-Mel-13 und seinen Transfektanten. Dargestellt sind die Mittelwerte mit den dazu gehörigen Standardabweichungen. Der Mittelwert von SK-Mel-13 wurde dem Wert 1 gleichgesetzt. Die Werte stammen aus der semiquantitativen Analyse der illumineszierenden Signale mit dem Programm TINA.
Die sagital gestrichelten Linien dienen der optischen Trennung der Zelllinien.
Ergebnisse 70
3.3.4 Schwache Livin-Expression in der Melanomzelllinie SK-Mel-13 sowie deren Transfektanten
SK-Mel-13, SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95 exprimierten Livin zu schwach um hier eine Unterscheidung der Expression beurteilen zu können (siehe Abb. 3.22).
Abb. 3.221: Schwache Expression von Livin. Western-Blot-Analyse von Livin in der Melanomzelllinie SK-Mel-13 und den Transfektanten SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95L nach Behandlung mit CH-11 (gelb), TNF-α (rot) und Doxycyclin (blau). Zum Vergleich wurden jeweils unbehandelte Zellen zur Kontrolle (K) aufgetragen. Der Livin-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:250, d.h. 1-2 μg /ml verwendet. Βeta-Aktin diente als Ladekontrolle. Es wird jeweils ein repräsentativer Blot von 3 in gleicher Form reproduzierten Ergebnissen abgebildet.
Ergebnisse 71
3.3.5 Verlust der FLIP-Expression in den SK-Mel-13-Transfektanten
Interessanterweise besaßen die Transfektanten SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95 im Gegensatz zur Ursprungszelle SK-Mel-13 nicht mehr die Fähigkeit FLIP zu exprimieren. Auch die Behandlung mit CH-11, TNF-α oder Doxycyclin führte zu keiner Re-Expression (siehe Abb. 3.23).
Abb. 3.23: Verlust der FLIP-Expression nach stabiler Transfektion. Western-Blot-Analyse für FLIP in der Melanomzelllinie SK-Mel-13 und den Transfektanten SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95L nach Behandlung mit CH-11 (gelb), TNF-α (rot) und Doxycyclin (blau). Zum Vergleich wurden jeweils unbehandelte Zellen zur Kontrolle (K) aufgetragen. Der FLIP-Antikörper mit einer Konzentration von 200 μg IgG/ml wurde in einer Verdünnung von 1:200 verwendet. Βeta-Aktin diente als Ladekontrolle. Es wird jeweils ein repräsentativer Blot von 3 in gleicher Form reproduzierten Ergebnissen abgebildet.
3.3.6 Unveränderte Smac-Expression nach Transfektion und Behandlung mit CH-11 , TNF-α und Doxycyclin
Bei der Ursprungszelle SK-Mel-13 sowie den transfizierten Zelllinien SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95 zeigte sich eine konstante Expression von Smac. Auch nach Behandlung mit CH-11, TNF-α oder Doxycyclin konnte keine Veränderung der Smac-Expression gefunden werden (siehe Abb. 3.24).
Ergebnisse 72
Abb. 3.24: Keine Veränderung der Smac-Expression nach Transfektion und Behandlung und Behandlung mit CH-11 (gelb), TNF-α (rot) und Doxycyclin (blau). Western-Blot-Analyse von Smac in der Melanomzelllinie SK-Mel-13 und den Transfektanten SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95L. Zum Vergleich wurden jeweils unbehandelte Zellen zur Kontrolle (K) aufgetragen. Der Smac-Antikörper mit einer Konzentration von 200 μg IgG/ml wurde in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Βeta-Aktin diente als Ladekontrolle. Gezeigt wird jeweils ein repräsentativer Blot von 3 in gleicher Form reproduzierten Ergebnissen.
3.3.7 Gesteigerte AIF-Expression bei SK-Mel-13-Transfektanten
Im Vergleich zur Melanomzelllinien SK-Mel-13 (1 +/- 0,2) zeigten die stabil transfizierten Zelllinien SK-Mel-13-Tet-On (1,6 +/- 0,2; p=0,05) und SKM13-CD95L (2 +/- 0,1;
p=0,003) eine Zunahme der AIF-Expression. Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Zellen fanden sich nicht (siehe Abb. 3.25).
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Abb. 3.25: Gesteigerte AIF-Expression bei SK-Mel-13-Transfektanten. Oben: Western-Blot-Analyse von AIF in der Melanomzelllinie SK-Mel-13 und den Transfektanten SK-Mel-13-Tet-On und SKM13-CD95L nach Behandlung mit CH-11 (gelb), TNF-α (rot) und Doxycyclin (blau). Zum Vergleich wurden jeweils unbehandelte Zellen zur Kontrolle (K) aufgetragen. Der AIF-Antikörper mit einer Konzentration von 200 μg IgG/ml wurde in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Βeta-Aktin diente als Ladekontrolle.
Gezeigt wird jeweils ein repräsentativer Blot von 3 in gleicher Form reproduzierten Ergebnissen. Unten:
Graphik zur optischen Darstellung der Expressionsstärke von AIF in SK-Mel-13 und seinen Transfektanten. Dargestellt sind die Mittelwerte mit den dazu gehörigen Standardabweichungen. Der Mittelwert von SK-Mel-13 wurde dem Wert 1 gleichgesetzt. Die Werte stammen aus der semiquantitativen Analyse der illumineszierenden Signale mit dem Programm TINA. Die sagital gestrichelten Linien dienen der optischen Trennung der Zelllinien.
3.4 Metaanalyse der anti- und proapoptotischen Proteine in