4. Ergebnisse
4.1. Analyse des immunregulatorischen Potentials von MSC
4.1.1. Expression wichtiger Komponenten der MHC-Klasse-I APM
mRNS-Expression von
2-Mikroglobulin. Während L87 und V54-2 sowie die primären MSC D38, D53 und D77 eine relativ hohe HC- und
2-MG-Proteinexpression aufwiesen, konnte in D24, D25 und D55 nur eine relativ geringe Proteinexpression beider Moleküle detektiert werden.
Weiterhin exprimierten manche Zellen relativ viel HC und wenig
2-MG auf Proteinebene, wie z.B. D2, D17 und D26. Generell war jedoch in allen mittel bis stark HC-exprimierenden Zellen eine starke Proteinexpression von
2-MG zu sehen.
Abb. 4.1: Expression der schweren und leichten Kette des MHC-Klasse-I Moleküls in primären und immortalisierten MSC.
Grafisch dargestellt ist die relative mRNS-Expression der schweren Kette des MHC-Klasse-I Moleküls (HC) (oben) und der leichten Kette des MHC-Klasse-I Moleküls 2 -Mikroglobulin ( 2-MG) (unten) der primären (MSCP91 - D83) und der immortalisierten MSC L87 und V54-2. Die Fehlerbalken (Standardabweichung vom Mittelwert) ergeben sich aus drei analysierten cDNS pro „Echt-Zeit“-PCR Experiment, exemplarisch ist hier ein repräsentatives Beispiel von drei unabhängigen „Echt-Zeit“-PCR-Experimenten gezeigt. Die korrespondierende
Proteinexpression der schweren Kette des MHC-Klasse-I Moleküls (HC) und 2-MG sowie des Standardproteins -Aktin ist unter der jeweiligen „Echt-Zeit“-PCR Grafik im Western Blot gezeigt. Es wurden 30 µg Gesamtprotein gelelektrophoretisch aufgetrennt. Es ist jeweils ein repräsentatives Beispiel von mindestens zwei unabhängigen Western Blot Experimenten gezeigt. MSC gesunder Spender sind unterstrichen und fett gekennzeichnet.
Die Expression des MHC-Klasse-I Moleküls auf der Zelloberfläche von MSC wurde
duchflusszytometrisch gemessen. Exemplarisch ist in Abbildung 4.2 die mittlere
Fluoreszenzintensität (MFI) der MHC-Klasse-I Zelloberflächenexpression von MSC eines
gesunden Spenders (D17), eines kranken Spenders (D38) sowie von immortalisierten MSC
(L87) zu sehen. Bezogen auf die Isotypkontrollen (IK) wurden für die beiden gesunden MSC
folgende MFI für MHC-Klasse-I gemessen: D17 (MFI = 38 ± 3,5) und D39 (MFI = 27,8 ± 2,8).
Die MFI-Werte (MHC-Klasse-I/IK) der MSC kranker Spender ergaben einen Mittelwert von 31 ± 4, n = 4 und lagen somit im Bereich der MHC-Klasse-I-Expression der gesunden Spender. Die immortalisierten MSC wiesen eine MFI (MHC-Klasse-I/IK) von 23 ± 1,2 (L87) und 11,4 ± 2,3 (V54-2) auf. Die im Vergleich zu den primären MSC erhöhte
2-MG- und HC-Proteinexpression der immortalisierten MSC L87 und V54-2 führte somit nicht zu einer verstärkten Expression von MHC-Klasse-I Molekülen auf der Zelloberfläche.
Abb. 4.2: Expression des MHC-Klasse-I Moleküls auf der Zelloberflächen von primären und immortalisierten MSC.
Dargestellt sind die kombinierten Fluoreszenzhistogramme der unspezifischen Phycoerythrin (PE)-konjugierten Isotypkontrolle (IK) (grau) und des spezifischen PE-konjugierten Antikörpers gegen MHC-Klasse-I (weiß) von primären MSC des gesunden Spenders (g) D17 (oben), des kranken Spenders (k) D38 (mitte) und der immortalisierten MSC L87 (unten). Die Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von MHC-I und IK sowie deren Quotient sind im Histogramm angegeben. Es ist jeweils ein repräsentatives Beispiel von drei unabhängigen Messungen gezeigt. x-Achse: logarithmische mittlere Fluoreszenzintensität (log MFI).
Die mRNS- und Proteinexpression der Komponenten der MHC-Klasse-I APM TAP1, TAP2
und Tapasin wurde in den MSC mittels „Echt-Zeit“-PCR und Western Blot analysiert. TAP1,
TAP2 und Tapasin wurden von den primären MSC auf mRNS-Ebene schwach exprimiert,
wohingegen in den immortalisierten MSC L87 und V54-2 eine starke mRNS-Expression
dieser Moleküle detektiert wurde (Abb. 4.3). Auch auf Proteinebene wiesen die
immortalisierten MSC eine stärkere Proteinexpression von TAP1 und TAP2 im Vergleich zu den primären MSC auf. Im Vergleich zu den MSC der beiden gesunden Spender D17 und D39 wurde in den primären MSC der elf kranken Spender eine heterogene Proteinexpression von TAP1, TAP2 und Tapasin detektiert. Während die Proteinexpression von TAP1 und TAP2 in einigen MSC kranker Spender (z.B. in MSCP91, D24, D25, D26, D55 und D66) mit der Proteinexpression dieser Moleküle in den MSC der gesunden Spender D17 und D39 vergleichbar war, so wurde in den MSC der kranken Spender D38, D53 und D77 eine vergleichsweise starke Proteinexpression von TAP1 und TAP2 detektiert. Die Proteinexpression von Tapasin verhielt sich ebenfalls heterogen. Die MSC-Linien L87 und V54-2 sowie die primären MSC der kranken Spender D2, D38, D77 und D83 wiesen eine relativ starke Tapasin-Proteinexpression auf. Im Gegensatz dazu zeichneten sich die MSC der übrigen kranken und gesunden Spender durch eine marginale Proteinexpression dieses Moleküls aus.
In den meisten Fällen wurde eine koordinierte Proteinexpression von TAP1, TAP2 und
Tapasin detektiert. So wurde in den immortalisierten MSC L87 und V54-2 als auch in den
primären MSC der kranken Spender D38, D53 und D77 eine relativ starke Proteinexpression
dieser Moleküle gemessen, während beispielsweise die MSC der kranken Spender
MSCP91, D24, D25 und D26 sowie die MSC der gesunden Spender D17 und D39 eine
schwache Proteinexpression dieser Moleküle zeigten.
Abb. 4.3: Expression von TAP1, TAP2 und Tapasin in primären und immortalisierten MSC.
Grafisch dargestellt ist die relative mRNS-Expression von TAP1 (oben), TAP2 (mitte) und Tapasin (unten) der primären (MSCP91
-D83) und der
immortalisierten MSC L87 und V54-2 auf mRNS-Ebene. Die Fehlerbalken
(Standard-abweichung vom
Mittelwert) ergeben sich aus drei analysierten cDNS pro „Echt-Zeit“-PCR Experiment, exemplarisch ist hier ein repräsentatives Beispiel von drei unabhängigen
„Echt-Zeit“-PCR-Experimenten gezeigt.
Die korrespondierende Proteinexpression von TAP1, TAP2 und Tapasin (TAPS) sowie des Standardproteins -Aktin ist unter der jeweiligen
„Echt-Zeit“-PCR Grafik im Western Blot dargestellt. Es wurden 30 µg Gesamtprotein gelelektrophoretisch aufgetrennt. Es ist jeweils ein repräsentatives Beispiel von mindestens zwei unabhängigen
Western Blot
Experimenten gezeigt.
MSC gesunder Spender sind unterstrichen und fett gekennzeichnet.
Interessanterweise zeichneten sich die primären MSC der elf Spender mit malignen Erkrankungen bzw. einer Infektion des Knochenmarks durch eine sehr heterogene Proteinexpression der MHC-Klasse-I APM Komponenten aus. Hingegen war das Proteinexpressionslevel dieser Moleküle innerhalb der beiden immortalisierten MSC-Linien sowie in den primären MSC der zwei gesunden Spender annähernd gleich. Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass sich primäre MSC kranker Spender generell durch eine heterogene Expression der MHC-Klasse-I APM Moleküle von primären MSC gesunder Spender unterscheiden. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde die Expression der genannten Moleküle in fünf weiteren primären MSC gesunder Spender (MSC 105 - MSC 126, Tab. 2.3) untersucht. Um vergleichende Aussagen treffen zu können, wurden die immortalisierten MSC L87 und V54-2 als Kontrollen mitgeführt.
Im Gegensatz zu den MSC kranker Spender wurde in den primären MSC der gesunden Personen MSC 105 - MSC 126 sowohl für HC als auch für
2-MG eine relativ homogene mRNS- und Proteinexpression detektiert (Abb. 4.4). Die MSC 105 - 126 wiesen eine nahezu gleich starke Proteinexpression wie L87 und V54-2 auf. Da die MSC der Spender MSC 105 – MSC 126 als Zellpellets zur Verfügung standen, konnte die Expression des MHC-Klasse-I Moleküls auf der Oberfläche dieser Zellen nicht untersucht werden.
Abb. 4.4: Expression der schweren und leichten Kette des MHC-Klasse-I Moleküls in primären MSC gesunder Spender sowie in immortalisierten MSC.
Grafisch dargestellt ist relative mRNS-Expression der schweren Kette des MHC-Klasse-I Moleküls (HC) (oben) und der leichten Kette des MHC-Klasse-I Moleküls
2-Mikroglobulin ( 2-MG) (unten) der primären MSC gesunder Spender (MSC 105 - 126) sowie der immortalisierten MSC L87 und V54-2. Die Fehlerbalken (Standardabweichung vom Mittelwert) ergeben sich aus drei analysierten cDNS pro „Echt-Zeit“-PCR Experiment, exemplarisch ist hier ein repräsentatives Beispiel von drei unabhängigen „Echt-Zeit“-PCR-Experimenten gezeigt. Die korrespondierende Proteinexpression der schweren Kette des MHC-Klasse-I Moleküls (HC) und 2-MG sowie des Standardproteins -Aktin ist unter der jeweiligen „Echt-Zeit“-PCR Grafik im Western Blot gezeigt. Es wurden 30 µg Gesamtprotein gelelektrophoretisch aufgetrennt. Es ist jeweils ein repräsentatives Beispiel von mindestens zwei unabhängigen Western Blot Experimenten gezeigt.
Auch TAP1 wurde von den primären MSC der fünf gesunden Spender MSC 105 - MSC 126 im Vergleich zu den primären MSC der kranken Spender sowohl auf mRNS als auch auf Proteinebene relativ homogen exprimiert (Abb. 4.5). Das mRNS-Expressionsniveau von TAP2 der primären MSC gesunder Spender ähnelte dem mRNS-Expressionsniveau dieses Moleküls in primären MSC kranker Spender: die immortalisierten MSC L87 und V54-2 zeichneten sich durch eine relativ starke mRNS-Expression von den primären MSC der gesunden Spender MSC 105 - 106 ab. Auf Proteinebene wurde wiederum eine im Vergleich zu den primären MSC der kranken Spender relativ homogene TAP2 Expression detektiert.
Tapasin wurde im Gegensatz zu den primären MSC der kranken Spender auf mRNS-Ebene relativ homogen exprimiert, d.h. für die primären MSC gesunder Spender und für die immortalisierten MSC L87 und V54-2 konnte ein ähnliches Expressionslevel gemessen werden. Während in den MSC kranker Spender eine heterogene Proteinexpression von Tapasin nachgewiesen wurde, so konnte in den MSC der gesunden Spender MSC 105 - MSC 126 nur eine, im Vergleich zu den immortalisierten MSC L87 und V54-2, marginale Proteinexpression dieses Moleküls detektiert werden.
Zusammenfassend konnte in MSC kranker Spender eine sehr heterogene Expression von
MHC-Klasse-I APM Molekülen detektiert werden, während sich die MSC gesunder Spender
durch eine relativ homogene Expression dieser Komponenten auszeichneten. Somit
bestätigen die Expressionsstudien von MHC-Klasse-I APM Molekülen in primären MSC der
gesunden Spender MSC 105 - MSC 126 die oben genannte Hypothese. Demnach scheinen
sich MSC gesunder und kranker Spender sehr stark in ihrer Immunogenität zu
unterscheiden.
Abb. 4.5: Expression von TAP1, TAP2 und Tapasin in primären MSC gesunder Spender und in immortalisierten MSC.
Grafisch dargestellt ist die relative mRNS-Expression von TAP1 (oben), TAP2 (mitte) und Tapasin (unten) der primären MSC gesunder Spender (MSC 105 -126) und der immortslisierten MSC L87 und V54-2 auf mRNS-Ebene.
Die Fehlerbalken (Standard-abweichung vom Mittelwert) ergeben sich aus drei analysierten cDNS pro „Echt-Zeit“-PCR Experiment, exemplarisch ist hier ein repräsentatives Beispiel von drei unabhängigen „Echt-Zeit“-PCR-Experimenten gezeigt. Die korrespondierende Protein-expression von TAP1, TAP2 und Tapasin (TAPS) sowie des Standardproteins -Aktin ist unter der jeweiligen „Echt-Zeit“-PCR Grafik im Western Blot gezeigt. Es wurden 30 µg Gesamtprotein elelektrophoretisch aufgetrennt. Es ist jeweils ein repräsentatives Beispiel von mindestens zwei unabhängigen Western Blot Experimenten gezeigt.