Die Entwicklung der Embryogenese kann teilweise durch bereits maternal bereitgestellte mRNA bis in spätere Entwicklungsstadien gesichert werden. Dies wurde beispielsweise sehr deutlich für den F-Aktin Regulator Wasp gezeigt. Hier konnte maternal bereitgestelltes Wasp bis in Stadium 14 detektiert werden. Zudem reicht die maternale Komponente aus um einen zygotischen Verlust von Wasp zu retten (Schafer et al. 2007). in situ-Analysen der drp1 und shark mRNA Verteilung zeigen, dass beide Proteine eine starke maternale Komponente aufweisen (Dissertation Freitag 2013). Bei der adulten Myogenese liegt keine maternale Komponente mehr vor. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit die adulte Flugmuskulatur als Model zur Analyse der potentiellen Interaktionspartner von Blow genutzt. Hierzu wurden verschiedene UAS-Konstrukte von shark und drp1 sowie entsprechende RNAi mittels zwei verschiedener Treiberlinien während der
adulten Myogenese, spezifisch in der indirekte Flugmuskulatur (IDF), exprimiert. Die Treiberlinie 1151-Gal4 wird in allen adulten Muskelvorläuferzellen (AMPs) während der Myoblastenfusion exprimiert. Actin88-Gal4 ist dagegen spezifisch für die IFMs und wird etwa in 18 Stunden nach APF, ab dem Zeitpunkt der Anheftung der Muskeln und nach der Myoblastenfusion, exprimiert (Weitkunat und Schnorrer 2014). Zusätzlich wurde Mef2-Gal4 genutzt, was schon ab Stadium 11 der Embryogenese aktiv ist, aber auch während der adulten Myogenese exprimiert wird. Die Analyse der DLMs von 1151Gal4>>UAS-shark ∆ kin-mcherry und Actin88Gal4>>UAS-shark ∆ kin-mcherry exprimierenden Fliegen wies keinen Unterschied im allgemeinen Aufbau der Myofibrillen im Vergleich zum Wildtyp auf (Rai et al. 2014).
Allerdings weisen die Muskeln in Actin88Gal4>>UAS-shark ∆ kin-mcherry exprimierenden Tieren innerhalb der einzelnen Muskeln eine Dissoziation einzelner Myofibrillenpakete auf.
Ebenso schien allgemein die Flugfähigkeit dieser Tiere beeinträchtigt zu sein, da sie eine deutliche Reduktion in ihrer Flugfähigkeit von 49% aufwiesen. Die Integrität der DLMs wurde über Paraffinschnitte beurteilt (Kooporation Arbeitsgruppe Dr. Halyana Shcherbata, MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen). In den longitudinalenund transversalen Paraffinschnitten zeigt sich, dass die Myofibrillen scheinbar weniger Zusammenhalt aufwiesen als in den Kontrollen. Die Reduktion der shark mRNA mittels RNAi hatte keinen sichtbaren Effekt auf die Integrität der Muskeln. Die Flugfähigkeit der Actin88Gal4>>UAS-shark ∆ kin-mcherry exprimierenden Tieren zeigt allerdings auch hier eine deutliche Reduktion von 50%. Die Expression von Shark, dem die Kinase-Domäne fehlt scheint demnach einen Effekt auf die Funktionalität der DMLs zu haben, wenn die Expression ab dem Zeitpunkt der Anheftung der Muskeln erfolgt.
Die Expression von Drp1 in den IFMs wurde ebenfalls untersucht. Die adulte Muskelentwicklung scheint in UAS-drp1-fl-mcherry exprimierenden Tieren nicht beeinträchtigt zu sein. Dagegen weisen Actin88Gal4>>UAS-drp ∆ GTPase-mcherry Fliegen keine normale Aktin-Filamentstruktur mehr auf. In Actin88Gal4>>UAS-drp1 ∆ GED-mcherry exprimierenden Tieren ist im Gegenteil dazu zwar eine geordnete Struktur zu beobachten, welche allerdings immer wieder von Aktin Ansammlungen unterbrochen wird. Der bei
Myosinfilamenten oder Anheftung der Muskelzelle an die Tendonzelle hinweisen. Die Expression des potentiell dominant-negativen Actin88Gal4>>UAS-drp1 T637D-mcherry scheint den Zusammenhalt der Myofibrillen zu beeinträchtigen. Die Expression von allen Konstrukten, besonders mit Actin88Gal4 führt zu einer Beeinträchtigung in der Flugfähigkeit. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Regulierung der Mitochondrien während der DLM Entwicklung eine Rolle zu spielen scheint. Paraffindünnschnitte der Embryonen zeigt ein ähnliches Bild. Die Muskeln in Actin88Gal4>>UAS-drp1 fl mcherry Tieren führt zu kleineren Myofibrillenbündel als dies im Wildtyp der Fall ist. Actin88Gal4>>UAS-drp1∆ GTPase-myc und Actin88Gal4>>UAS-drp1 ∆ GED-myc exprimierende Tiere weisen eine drastischen Reduktion in der Muskelgröße mit gleichbleibender Anzahl auf. Die Expression von Actin88Gal4>>UAS-drp-fl-myc führt zu etwas verkleinerten Myofibrillenbünden. Wird die Menge an Drp1 reduziert sind die Muskelbündel etwas dünner ausgeprägt als im Wildtyp. Die Expression von Drp1 Konstrukten mit actin88-Gal4 führt allerdings in allen Fällen zu einer Reduktion der durchschnittlichen Flugfähigkeit um etwa 50%. Wird die Drp1 RNAi dagegen mittels actin88-Gal4 exprimiert, führt dies zu einer nicht ganz so starken Reduktion von lediglich 25%. Die Daten weisen darauf hin, dass die Regulation der GTPase- und GED-Domäne von Drp1 eine Bedeutung für die Entwicklung der DLM hat, da die Expression von Deletionskonstrukten einen drastischen Effekt auf diese zu haben scheint. Die Runterregulierung von Drp1 mittels RNAi dagegen, führt zu keinem stark ausgeprägten Defekt. Es konnte gezeigt werden, dass der Verlust von Drp1 zu einer stärkeren Vernetzung der Mitochondrien in L3-Larven führt. Die Reduzierung von Drp1 mit Hilfe von RNAi führt allerdings scheinbar zu keiner Beeinträchtigung in der Funktionalität der Mitochondrien (Wang et al. 2016).
Möglicherweise führt die Expression der Deletionskonstrukte zu einer verminderten Funktionalität der Mitochondrien und damit zur Mitophagie. Dies könnte die Bereitstellung von ATP für die Etablierung der Aktinfilamente stark reduzieren, was die bei Actin88Gal4>>UAS-drp1∆ GTPase-myc und Actin88Gal4>>UAS-drp1 ∆ GED-mcherry exprimierenden Tieren induzierten Phänotypen erklären könnte. Es ist des Weiteren noch ungeklärt, ob die Degeneration der Muskeln dabei eine Rolle spielt, bei der eine zeitliche Komponente ebenfalls wichtig sein könnte. Dafür könnte die Präparation der Fliegen zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung der DLM sowie die Expression von mito-GFP hilfreich sein. Die Messung des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm), um eine Auskunft
über die Integrität der Mitochondrien zu erhalten kann zusätzlich interessant sein. Es gibt Hinweise darauf, dass der Verlust oder eine alterierte Expression von Drp1 zu degenerativen Erkrankungen führt. Die Förderung der mitochondrialen Teilung kann beispielsweise degenerative Phänotypen in pink1- und parkin-Mutanten retten (Deng et al. 2008; Poole et al.
2008; Yang et al. 2008). Dies könnte die mit Actin88Gal4>>UAS-drp1∆ GTPase-myc und Actin88Gal4>>UAS-drp1 ∆ GED-mcherry beobachteten Phänotypen erklären. Eine ultrastrukturelle Untersuchung kann dazu weitere Hinweise geben. Blow und Shark dagegen sind bis jetzt noch nicht für die IFM beschrieben worden. Eine Frage die sich für alle Expressionsexperimente der IFM stellt ist, ob die Proteine zum einen endogen vorkommen und zum anderen, ob sie die gleiche Funktion einnehmen wie dies bereits für die Embryogenese beschrieben wurde. Aus der Muskelentwicklung während der Embryogenese ist bekannt, dass die Funktion der Proteine unterschiedlich in verschiedenen Muskelgruppen ist. So ist beispielsweise bekannt, dass die Funktion für die somatische Muskulatur eine andere ist als die während der visceralen Entwicklung (Rudolf et al. 2014). Das muss in der IFM noch untersucht werden. Ein Aspekt der sehr auffallend ist, ist dass die beobachteten Defekte ausschließlich mit der Expression von Actin88Gal4 zu beobachten waren, nicht jedoch mit Mef2-Gal4 oder 1151Gal4.
Da wäre es interessant zu überprüfen, ob die Expressionsintensität bei den Treiberlinien vergleichbar ist. Für die Expression von UAS-mCD8-GFP mit den Treiberlinien actin88Gal4 und 1151Gal4 konnte ab 24 Stunden APF in vivo ein GFP Signal in den drei Muskeltemplates beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Zur Weiteren Charakterisierung, besonders bei den Experimenten, bei denen die Muskeln im Vergleich zum Wildtyp kleiner waren, würde eine Kernzählung Aufschluss über einen Fusionsdefekt geben.