Expression und Membranlokalisierung

Daher war es nötig, die Signaltransduktion der WT-Konstrukte in einer Zelllinie zu untersuchen, die keinen endogenen TNF-Rezeptor exprimiert.

107

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-pRK5 pRK5-TNFR1 pRK5-TNFR1ΔDD pRK5-TNFR1-CTAR2

pRK5 pRK5-TNFR1 pRK5-TNFR1ΔDD pRK5-TNFR1-CTAR2

Pellet Überstand

kDa

94

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Pellet Überstand

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Abb. 4.15 Expression in TNFR1/2 defizienten Mausfibroblasten Abb. 4.15 Expression in TNFR1/2 defizienten Mausfibroblasten

1x10⁷ Zellen wurden mit 3 μg der angegebenen Expressionsplasmide, 2 μg pRK5-HA-JNK1 und 2 μg eines Expressionsplasmids für p35 elektroporiert. Die Gesamt-DNA-Menge wurde mit Lachsspermien-DNA auf 20 μg aufgefüllt. Die Transfektion der Zellen erfolgte durch Elektroporation mit 250 V und 975 μF. 24 h nach der Transfektion wurde die Expression der Konstrukte, wie in Abschnitt 3.6.1 beschrieben, analysiert. Zum Nachweis der Konstrukte wurde der TNFR1-Antikörper H-5 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) verwendet.

1x10⁷ Zellen wurden mit 3 μg der angegebenen Expressionsplasmide, 2 μg pRK5-HA-JNK1 und 2 μg eines Expressionsplasmids für p35 elektroporiert. Die Gesamt-DNA-Menge wurde mit Lachsspermien-DNA auf 20 μg aufgefüllt. Die Transfektion der Zellen erfolgte durch Elektroporation mit 250 V und 975 μF. 24 h nach der Transfektion wurde die Expression der Konstrukte, wie in Abschnitt 3.6.1 beschrieben, analysiert. Zum Nachweis der Konstrukte wurde der TNFR1-Antikörper H-5 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) verwendet.

Das Verteilungsmuster der einzelnen Konstrukte in Überstand und Pellet unterschied sich etwas von dem Muster, das in HEK293 beobachtet wurde (siehe Abb. 4.13). In Abb. 4.15 war zu sehen, dass der TNFR1 nur im Triton-X100 unlöslichen Pellet nachgewiesen werden konnte. TNFR1ΔDD sowie TNFR1-CTAR2 konnten sowohl im Überstand als auch im Pellet detektiert werden.

Das Verteilungsmuster der einzelnen Konstrukte in Überstand und Pellet unterschied sich etwas von dem Muster, das in HEK293 beobachtet wurde (siehe Abb. 4.13). In Abb. 4.15 war zu sehen, dass der TNFR1 nur im Triton-X100 unlöslichen Pellet nachgewiesen werden konnte. TNFR1ΔDD sowie TNFR1-CTAR2 konnten sowohl im Überstand als auch im Pellet detektiert werden.

In HEK293 Zellen konnte keine Stimulierung des TNFR1 durch TNFα gezeigt werden (siehe Abb. 4.14). Wie bereits angesprochen, könnte ein möglicher Grund sein, dass der Rezeptor nicht auf der Zelloberfläche exprimiert wurde. Als nächster Schritt sollte daher geklärt werden, ob die Rezeptorkonstrukte auf der Zelloberfläche von TNFR1/2^-/- Zellen exprimiert werden.

In HEK293 Zellen konnte keine Stimulierung des TNFR1 durch TNFα gezeigt werden (siehe Abb. 4.14). Wie bereits angesprochen, könnte ein möglicher Grund sein, dass der Rezeptor nicht auf der Zelloberfläche exprimiert wurde. Als nächster Schritt sollte daher geklärt werden, ob die Rezeptorkonstrukte auf der Zelloberfläche von TNFR1/2^-/- Zellen exprimiert werden.

TNF-R1 Isotyp Antikörper

pRK5-TNFR1

pRK5-TNFR1ΔDD pRK5

pRK5-TNFR1-CTAR2

TNF-R1 Isotyp Antikörper

pRK5-TNFR1

pRK5-TNFR1ΔDD pRK5

pRK5-TNFR1-CTAR2

Abb. 4.16: TNFR1-CTAR2 und TNFR1ΔDD werden auf der Zelloberfläche exprimiert Abb. 4.16: TNFR1-CTAR2 und TNFR1ΔDD werden auf der Zelloberfläche exprimiert

TNFR1/2 defiziente Mausfibroblasten wurden mit 1,5 μg der angegebenen Expressionsvektoren, 1 μg eines GFP-Expressionsvektor sowie 0,5 μg eines p35-Expressionsvektors mittels Lipofektion transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen wie in Abschnitt 3.2.4 beschrieben gefärbt. Als Primärantikörper wurde der α-TNFR1-Antikörper H-5 verwendet, als Isotypkontrolle der α-ERK2-Antikörper D-2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Als Sekundärantikörper wurde ein Cy^TM5-konjugierter α-Maus-Antikörper verwendet (Jackson ImmunoResearch). In der ersten sowie dritten Spalte sind FACS-Profile gezeigt, in denen SSC gegen FSC aufgetragen wurde. Die dort markierten Zellen stellten die Population der überlebenden Zellen dar. Von den Zellen dieser Population wurde dann jeweils in der zweiten und vierten Spalte GFP gegen Cy™5 aufgetragen.

TNFR1/2 defiziente Mausfibroblasten wurden mit 1,5 μg der angegebenen Expressionsvektoren, 1 μg eines GFP-Expressionsvektor sowie 0,5 μg eines p35-Expressionsvektors mittels Lipofektion transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen wie in Abschnitt 3.2.4 beschrieben gefärbt. Als Primärantikörper wurde der α-TNFR1-Antikörper H-5 verwendet, als Isotypkontrolle der α-ERK2-Antikörper D-2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Als Sekundärantikörper wurde ein Cy^TM5-konjugierter α-Maus-Antikörper verwendet (Jackson ImmunoResearch). In der ersten sowie dritten Spalte sind FACS-Profile gezeigt, in denen SSC gegen FSC aufgetragen wurde. Die dort markierten Zellen stellten die Population der überlebenden Zellen dar. Von den Zellen dieser Population wurde dann jeweils in der zweiten und vierten Spalte GFP gegen Cy™5 aufgetragen.

Um die Lokalisierung der Konstrukte auf der Zelloberfläche analysieren zu können, wurde ein Antikörper (H5, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) verwendet, der ein Epitop in der extrazellulären Domäne des TNFR1 erkennt. Zur Detektion diente ein Cy^TM5-konjugierter Sekundärantikörper. Nach dem Färben der Zellen (siehe Abschnitt 3.2.5) wurden sie mittels Durchflusszytometrie analysiert. Um auch in diesem Experiment keinen Hintergrund durch endogenen Rezeptor zu bekommen, wurden die TNFR1/2-defizienten Mausfibroblasten verwendet. Die Zellen wurden mit Expressionsvektoren für die verschiedenen Konstrukte Um die Lokalisierung der Konstrukte auf der Zelloberfläche analysieren zu können, wurde ein Antikörper (H5, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) verwendet, der ein Epitop in der extrazellulären Domäne des TNFR1 erkennt. Zur Detektion diente ein Cy^TM5-konjugierter Sekundärantikörper. Nach dem Färben der Zellen (siehe Abschnitt 3.2.5) wurden sie mittels Durchflusszytometrie analysiert. Um auch in diesem Experiment keinen Hintergrund durch endogenen Rezeptor zu bekommen, wurden die TNFR1/2-defizienten Mausfibroblasten verwendet. Die Zellen wurden mit Expressionsvektoren für die verschiedenen Konstrukte

bzw. pRK5-Leervektor als Kontrolle transfiziert. Zusätzlich wurden die Zellen mit pEGFP-C1 transfiziert. Als Isotypkontrolle wurde anstelle des spezifischen α-TNFR1-Antikörpers der Antikörper α−ERK2 verwendet.

Wie in Abb. 4.16 zu sehen, konnte eine Expression von TNFR1-CTAR2 und TNFR1ΔDD auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Bei den Zellen, die positiv für GFP und Cy^TM5 waren, konnte eine Korrelation zwischen der Intensität des GFP-Signals und des Cy^TM 5-Signals beobachtet werden. Dies bedeutet, dass die Menge der GFP-Expression proportional zu der Menge der exprimierten TNFR1-Konstrukte war. Allerdings konnte auch eine GFP-positive Population beobachtet werden, die Cy^TM5-negativ war und daher kein TNFR1-Konstrukt auf der Oberfläche exprimiert. Der TNFR1 Wildtyp konnte nicht auf der Oberfläche nachgewiesen werden. Ein möglicher Grund dafür war, dass nur die lebenden Zellen nach GFP und Cy^TM5 aufgetragen wurden, da die sterbenden und toten Zellen eine hohe Eigenfluoreszenz in dem Kanal aufwiesen, in dem auch die Cy^TM5 Fluoreszenz analysiert wurde. Die Überexpression des TNFR1 Wildtyp könnte dazu geführt haben, dass es in den transfizierten Zellen zur Induktion von Zelltod gekommen ist. Ein Hinweis darauf ist auch die Tatsache, dass im TNFR1-Ansatz deutlich weniger und schwächer GFP-positive Zellen vorhanden waren. Auf diese Beobachtung soll zu einem späteren Zeitpunkt noch genauer eingegangen werden.

Es konnte also gezeigt werden, dass TNFR1, TNFR1ΔDD und TNFR1-CTAR2 bei Verwendung von pRK5 als Expressionsvektor in TNFR1/2^-/- Zellen exprimiert werden können. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass TNFR1ΔDD und TNFR1-CTAR2 auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Diese Konstrukte und die TNFR1/2^-/- Zellen stellen also ein System dar, in dem nun die Signaltransduktion der verschiedenen Rezeptorkonstrukte näher charakterisiert werden kann.

4.5.2.2 Aminosäuren 370-386 von LMP1 sind im TNFR1-Kontext