Zur Untersuchung heteromerer HCN24-Kanäle wurden elektrophysiologische Untersu-chungen an Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis nach Koinjektion von HCN2- und HCN4-RNA durchgeführt. Die Kanäle generierten große Ströme in Oozyten-Patches (siehe Bild 4.1) (Chen et al., 2001b; Ulens und Tytgat, 2001; Zhang et al., 2009), dabei bestätige sich, dass die HCN2-Untereinheiten der Maus mit den HCN4-Untereinheiten der Maus genauso zuverlässig zu heteromeren HCN24-Kanälen koassemblieren (Fischer, 2012) wie mit HCN4-Untereinheiten des Menschen (Zhang et al., 2009). Dies war zu erwarten, da die Sequenzübereinstimmung der Untereinheiten zwischen Mensch und Maus sehr groß ist. Für den HCN2-Kanal beträgt die DNA-Sequenzübereinstimmung zwischen Mensch und Maus 94 % (Ludwig et al., 1999) und die Sequenzübereinstimmung der Ami-nosäuren für den HCN4-Kanal zwischen den Spezies beträgt 98 % (Santoro et al., 1998).
Die Eigenschaften der Kanäle, die nach Koinjektion von HCN2- und HCN4-RNA der Maus entstehen, lassen sich nicht aus einer reinen Kombination der Eigenschaften homo-merer HCN2- und HCN4-Kanäle erklären. Die halbmaximalen Aktivierungsspannungen V0,5 der Kanäle nach Koinjektion waren bei Messungen in der Cell-attached-Konfiguration positiver als die von den homomeren HCN2- oder HCN4-Kanälen. Damit konnten frühere Ergebnisse, die mit der Zwei-Mikroelektroden-Voltage-Clamp-Methode gewonnen wurden (Zhang et al., 2009; Fischer, 2012), bestätigt werden. Die einfachste Erklärung für diese neuen biophysikalischen Eigenschaften ist der Einbau heteromerer Kanäle in die Oozyten-membran.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Eigenschaften der heteromeren HCN24-Kanäle in der Inside-out-Konfiguration noch detaillierter beschrieben. Es wurden neben der halbma-ximalen Aktivierungsspannung V0,5, die effektive Gating-Ladung zδ und die Aktivierungszeitkonstante τ der spannungsinduzierten Aktivierung der heteromeren HCN24-Kanäle ermittelt, sowie die Beeinflussung dieser Parameter durch verschiedene Ligandenkonzentrationen gemessen.
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Um herauszufinden, ob die heteromeren HCN24-Kanäle mit einer bevorzugten Stöchio-metrie gebildet werden, wurden die HCN2-RNA und die HCN4-RNA in verschiedenen Mischungsverhältnissen koinjiziert. Die RNAs wurden vor Injektion in den molekularen Verhältnissen 1:10, 1:1 und 10:1 gemischt.
Wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, dass bei einem Mischungsverhältnis von 1:10 oder 10:1 ausschließlich homomere Kanäle in die Oozytenmembran eingebaut wurden? Unter der Annahme, dass das Verhältnis der RNA in das gleiche Proteinverhältnis umgesetzt wird und sich die Untereinheiten HCN2 und HCN4 mit gleicher Wahrscheinlichkeit mit sich selbst und mit der jeweils anderen Isoform zu einem Kanal zusammenlagern (Whita-ker et al., 2007), überwogen bei Injektion gleich vieler RNA-Moleküle HCN2 und HCN4 (Mischungsverhältnis 1:1) die heteromeren Kanäle (Bild 5.1A). Bei den Mischungsver-hältnissen 1:10 und 10:1 wurden sehr wahrscheinlich wesentlich mehr homomere als heteromere HCN-Kanäle in die Membran eingebaut (Bild 5.1B).
Es wäre also zu erwarten, dass die elektrophysiologischen Eigenschaften nach Injektion der Mischungsverhältnisse 10:1 und 1:10 von denen des homomeren HCN2- bzw. HCN4-Kanals bestimmt werden und sich damit von den Eigenschaften nach Injektion des Misch-ungsverhältnisses 1:1 unterscheiden. Entgegen dieser Vermutung konnten bei Messungen mit der Zwei-Mikroelektroden-Voltage-Clamp-Methode keine Unterschiede in den Eigen-schaften festgestellt werden (Zhang et al., 2009). Unabhängig vom injizierten Mischungsverhältnis ergaben die Messungen eine positivere halbmaximale Spannung als die der beiden homomeren Kanäle HCN2 und HCN4 und ihre spannungsinduzierte Akti-vierung war genauso schnell wie die des homomeren Kanals HCN2. Diese Ergebnisse wurden in der vorliegenden Arbeit durch Messungen in der Cell-attached-Konfiguration bestätigt.
Auch die Messungen in der Inside-out-Konfiguration zeigten gleiche Eigenschaften für HCN24-Kanäle nach Koinjektion von RNA in den Mischungsverhältnissen 1:1 und 1:10.
Nur für Kanäle nach Koinjektion im Mischungsverhältnis 10:1 zeigte sich nach dem Exzi-dieren eine Abweichung der Eigenschaften von den anderen Mischungsverhältnissen 1:1 und 1:10. Die Eigenschaften der Kanäle nach Koinjektion von HCN24 10:1 glichen sich denen des homomeren HCN2-Kanals an. Deshalb ist davon auszugehen, dass die Eigen-schaften der Kanäle nach Koinjektion von HCN24 1:1 und HCN24 1:10 von heteromeren HCN24-Kanälen bestimmt sind und lediglich nach Koinjektion des Mischungsverhältnis-ses 10:1 stark überwiegend von homomeren HCN2-Kanälen.
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Bild 5.1: Theoretische Zusammensetzung der HCN-Untereinheiten im Patch
Dargestellt ist die Wahrscheinlichkeit der möglichen Kombinationen der HCN2- (schwarz) und HCN4-Untereinheiten (grau) in einem Kanalprotein unter Berücksichtigung des molekularen Mischungsverhältnisses der HCN2- und HCN4-RNA in der Injektionslösung (Whitaker et al., 2007). A) Das Histogramm zeigt die Wahrscheinlichkeit für das Mischungsverhältnis 1:1. B) Das Histogramm zeigt die Wahrscheinlichkeit für das Mischungsverhältnis 1:10. Die Wahrscheinlich-keit für homomere HCN2-Kanäle beträgt 0,00007. Die theoretische WahrscheinlichWahrscheinlich-keit für HCN24-Kanäle bestehend aus drei HCN2-Untereinheiten und einer HCN4-Untereinheit beträgt 0,0027. Für die Injektion der HCN2- und HCN4-RNA im Mischungsverhältnis 10:1 wird die Wahrscheinlichkeit der möglichen Kombinationen durch das Spiegelbild von B) dargestellt.
Wie sind die heteromeren HCN24-Kanäle aufgebaut? Um die gleichen elektrophysiolo-gischen Eigenschaften der Kanäle nach Koinjektion von HCN24 1:1 und HCN24 1:10 zu erklären, gibt es zwei Möglichkeiten: 1) eine bevorzugte Stöchiometrie bei der Zusammen-setzung heteromerer HCN24-Kanäle oder 2) gleiche Eigenschaften aller heteromeren HCN24-Kanäle unabhängig von ihrer Stöchiometrie. Aufgrund der sehr hohen Präferenz für eine 2:1:1 Stöchiometrie der CNGA2-, CNGA4- und CNGB1b-Untereinheiten der verwandten olfaktorischen CNG-Kanäle (Zheng und Zagotta, 2004), die weitgehend unab-hängig von der angebotenen RNA-Mischung umgesetzt wird, ist es denkbar, dass es auch bei heteromeren HCN-Kanälen eine bevorzugte Stöchiometrie gibt. Whitaker und Mitar-beiter (2007) konnten aber nachweisen, dass sich HCN2- und HCN4-Untereinheiten mit gleicher Präferenz mit sich selbst oder der anderen Untereinheit zu Kanaltetrameren zu-sammenlagern (Whitaker et al., 2007). Ulens und Tytgat (2001) haben die biophysikalischen Eigenschaften von Oozyten nach Injektion von HCN1-HCN2-Dimeren und nach Injektion von gleichen Mengen HCN1- und HCN2-RNA untersucht. Sie waren nicht voneinander zu unterscheiden (Ulens und Tytgat, 2001). Unter Berücksichtigung der
Wahrscheinlichkeit
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Arbeit von Whitaker und Mitarbeitern (2007) sprechen die Ergebnisse von Ulens und Tytgat (2001) für die zweite der oben aufgeführten Möglichkeiten, die elektrophysiolo-gischen Eigenschaften der heteromeren HCN24-Kanäle zu erklären. Das würde bedeuten, dass heteromere HCN-Kanäle mit unterschiedlicher Stöchiometrie, aber gleichen Eigen-schaften in die Oozytenmembran eingebaut wurden.
Da nach der Koinjektion von HCN2- und HCN4-RNA neben dem Einbau heteromerer Kanäle mit hoher Wahrscheinlichkeit vom Einbau homomerer HCN-Kanäle in die Mem-bran der Oozyten ausgegangen werden kann (Bild 5.1), sollte trotz der Ergebnisse von Ulens und Tytgat die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass sich die Eigenschaften der heteromeren Kanäle noch stärker als gezeigt von denen der homomeren Kanäle unter-scheiden.
Die Eigenschaften von heteromeren HCN24-Kanälen werden wahrscheinlich am besten bei Koinjektion von HCN24 1:10 beschrieben. Bei der Koinjektion in diesem Mischver-hältnis müssten zwar überwiegend homomere HCN4-Kanäle in die Membran eingebaut worden sein (Bild 5.1), aber die Eigenschaften der unter diesen Bedingungen vermessenen Kanäle unterschieden sich deutlich von denen homomerer HCN4-Kanäle. Die V0,5-Werte nach Koinjektion von HCN24 1:10 waren in der Cell-attached-Konfiguration und in der Inside-out-Konfiguration ohne cAMP am weitesten von denen der beiden homomeren HCN-Kanäle entfernt – ganz im Gegensatz zu den V0,5-Werten nach Koinjektion von HCN24 10:1. Die Eigenschaften dieser Patches waren wahrscheinlich von denen homo-merer HCN2-Kanäle dominiert, sodass sich ihre Eigenschaften kaum unterschieden.
Kanäle nach Koinjektion von HCN24 1:10 unterschieden sich nicht nur in der spannungs-induzierten Aktivierung im Gleichgewicht von HCN4-Kanälen, sondern auch in der Modulation durch cAMP und der spannungsinduzierten Aktivierungskinetik. Die Aktivie-rungskurve von Kanälen nach Koinjektion von HCN24 1:10 wurde von cAMP schon in zehnfach geringerer Konzentration zu positiveren Spannungen verschoben als die Gleich-gewichts-Aktivierung von HCN4-Kanälen. Zudem aktivierten Kanäle nach Koinjektion von HCN24 1:10 wesentlich schneller als HCN4-Kanäle. Damit aktivierten sie genauso schnell wie die Kanäle HCN2, HCN24 10:1 und HCN24 1:1.
Die wesentlich geringeren Stromamplituden der Patches mit homomeren HCN4-Kanälen und nach Koinjektion von HCN24 1:10 (siehe Bild 4.2) lassen als eine Erklärung zu, dass HCN4-Kanäle bei gleicher RNA-Menge in geringerer Zahl in die Oozytenmembran einge-baut wurden. Diese Vermutung konnte mit immunzytologischen Techniken widerlegt
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werden (Kusch et al., 2013). Mit fluorophorgekoppelten Antikörpern markierte HCN4-Untereinheiten erzeugten Fluoreszenzintensitäten, die nicht signifikant geringer waren als die nach immunzytologischer Markierung von HCN2-Untereinheiten. Auch nach Koex-pression von HCN2- und HCN4-Untereinheiten im Verhältnis 1:1 und anschließender Markierung der HCN4-Untereinheiten änderte sich die Fluoreszenzintensität nicht signifi-kant. Die Stromamplitude nahm aber zu. Das heißt, dass homomere HCN4-Kanäle genauso gut in die Oozytenmembran eingebaut wurden wie homomere HCN2-Kanäle. Sie besitzen aber wahrscheinlich eine geringere Offenwahrscheinlichkeit, was zu geringen Stromamplituden bei alleiniger HCN4-Expression führt und eventuell den geringen Ein-fluss der homomeren HCN4-Kanäle auf die elektrophysiologischen Eigenschaften nach Koexpression von HCN2- und HCN4-Untereinheiten im Verhältnis 1:10 erklärt. Dies könnte mit Einzelkanaluntersuchungen geklärt werden (Thon et al., 2013).