Expression des NL6 Epitops in humanen Modellneuronen

Neurofilamente werden nur in ausdifferenzierten Neuronen exprimiert, und werden zudem posttranslational stark modifiziert. Ihre Expression startet während der neuronalen Morphogenese und erreicht ihren Höhepunkt erst, wenn die Neuronen zu ihren Zielzellen Kontakt aufgenommen haben. Viele monoklonale Antikörper, die Neurofilament-Proteine erkennen, sind abhängig von spezifischen Modifikationen.

Mit Hilfe der humanen neuronalen Zelllinie NT2, die sich in vitro durch Behandlung mit Retinsäure (RA) zu postmitotischen Neuronen (NT2N) differenziert, kann die Entwicklung von humanen Neuronen im Kultursystem untersucht werden. Es wurden daher zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Differenzierung Zell-Lysate hergestellt und mittels eines Immunblots analysiert. Dazu wurde die Expression des NL6 Antigens (NF-M) während der Reifung der Neuronen bestimmt und das NL6 Signal mit dem eines Kontroll-Antikörpers (M20) verglichen, der NF-M unabhängig von posttranslationalen Modifikationen erkennt.

Die Analyse zeigte, dass sich NF-M erstmalig zwischen der zweiten und dritte Woche während der Differenzierung der NT2 Zellen mit RA immunbiochemisch nachweisen lässt (Abb. 3.2). Dabei sind keine auffälligen Unterschiede im relativen Verhältnis der Signale von NL6 und M20 zu beobachten. Dies deutet darauf hin, dass beide Antikörper NF-M gleichermaßen erkennen. Als Referenzprotein zum Nachweis vergleichbarer Proteinmengen wurde in diesem Fall das konstitutiv exprimierte Aktin verwendet.

NL6

M20

Akt in

0 7 14 21 24 28 31 35 Tage RA-Beh an d lun g

NT2 NT2N

Abb. 3.2: Immunblot-Analyse der NF-M Expression während der Differenzierung von NT2 Zellen. NT2 bzw. NT2N Zellen wurden nach verschiedenen Zeitpunkten während der fünfwöchigen Differenzierung durch Retinsäure (RA) lysiert und je 10 µg (NF-M) bzw. 1 µg (Aktin) Protein wurden über eine 7.5%ige (NF-M) bzw.

10%ige (Aktin) SDS-PAGE aufgetrennt. Nach dem Transfer auf eine PVDF-Membran wurde der 7.5%ige Immunblot nacheinander mit NL6 und M20 (nach vorherigen Strippen) und der 10%ige Immunblot mit α-Aktin analysiert.

Das langsame Ansteigen der NF-M Expression könnte zwei Gründe haben. Einerseits könnte das zunehmende Signal bedeuten, dass in allen Zellen die NF-M Expression langsam zunimmt. Andererseits könnten auch einzelne Zellen sehr stark NF-M exprimieren während andere es nur schwach oder gar nicht exprimieren, da nicht geklärt ist, ob sich im NT2/NT2N-Kultursystem alle Zellen gleichmäßig und zeitgleich differenzieren.

Um dies zu klären, wurden NT2/NT2N Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Differenzierung durch RA auf Deckgläschen ausplattiert und mit NL6 und gegen αNestin immungefärbt (Abb. 3.3).

Die Aufnahmen in Abbildung 3.3 zeigen, dass nach 20 Tagen nicht alle der Zellen NF-M (NL6) exprimieren, wobei das Expressionsniveau der exprimierenden Zellen sehr hoch war.

In den Zellen waren die NL6 Signale in bestimmten Bereichen stark angereichert.

Siehe Abbildungen 1

Abb. 3.3: Immunfluoreszenzfärbung von NT2-NT2N Zellen während der RA Differenzierung. NT2 Zellen wurden 20 Tage mit RA behandelt, auf Kollagen-beschichtete Deckgläschen ausplattiert, drei Tage später standardfixiert und mit NL6 und αNestin (JP39) doppelgefärbt. Maßstabsbalken entspricht 20 µm.

Auswertungen mehrerer Gesichtsfelder ergaben, dass nach 20 Tagen fast 90 % der Zellen eine NF-M Expression zeigten (Abb. 3.4). Die Expression war erstmals nach acht Tagen detektierbar, wobei sie bis zum Tag 25 stetig zunahm. Insgesamt differenzierten sich etwa 85 bis 95% der NT2 Zellen soweit, dass sie NF-M exprimierten.

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

6 8 10 12 16 20 25 30 35

Tage RA Beh an d lun g Anteil NL6 positiver Zellen an Gesamtzellzahl in %

Abb. 3.4: Anzahl der NL6 positiven NT2-NT2N Zellen während der RA Differenzierung. NT2 Zellen wurden an unterschiedlichen Zeitpunkten während der RA Behandlung auf Kollagen-beschichtete Deckgläschen ausplattiert, drei Tage später standardfixiert und mit NL6 und DAPI gefärbt. Zur Quantifizierung wurden fünf unabhängige Gesichtfelder im Mikroskop ausgezählt und der Anteil der NL6 positiven Zellen bestimmt.

Mittelwert und Standardfehler sind gezeigt.

In differenzierten Neuronen werden Neurofilamente in den unterschiedlichen

unphosphoryliert oder sehr wenig phosphoryliert, während die NFs in den Axonen sehr viele Phosphate tragen. Deshalb können z.B. Phosphorylierungs-abhängige NF-Antikörper spezifisch unterschiedliche Bereiche im Neuron anfärben.

Um zu überprüfen, ob der Antikörper NL6 in den Neuronen eine gleichmäßige Verteilung zeigt, wurden NT2N Zellen mit NL6 und monoklonalen Antikörpern gegen NF-M (M20) bzw. unphosphoryliertes NF-H (SMI32) doppelgefärbt und mittels konventioneller Immunfluoreszenz-Mikroskopie analysiert.

Siehe Abbildungen 1

Abb. 3.5: Immunfluoreszenzaufnahmen von NT2N Zellen. NT2N Zellen wurden nach siebenwöchiger Differenzierung auf Kollagen-beschichtete Deckgläschen ausplattiert und vier Tage später standardfixiert. Die Zellen wurden mit NL6 und M20 bzw. SMI32 doppelgefärbt und mit einem konventionellen Immunfluoreszenzmikroskop analysiert. Die Photos wurden mit einer AxioCam MRC Kamera von Zeiss aufgenommen. Maßstabsbalken entspricht 20 µm.

NL6 zeigte ein filamentöse Verteilung im gesamten Neuron, die stellenweise stark konzentriert war. Die stärkste Anreicherung war im Zellsoma zu erkennen, wobei aber auch alle Fortsätze von NL6 gefärbt wurden. NL6 zeigte dieselbe Verteilung wie der NF-M Antikörper M20 (Abb. 3.5, oben), der Gesamt-NF-M in den Zellen detektiert. Der SMI32 Antikörper hingegen erkennt NF-H nur, wenn das Epitop nicht phosphoryliert ist. Deshalb färbt er vor allem neuronales Soma, die Dendriten und nur Axone mit großen Durchmesser, da die meisten Neurofilamente im Axon phosphoryliert sind, so dass das Epitop maskiert ist.

Diese spezifische Verteilung der phosphorylierten Epitope auf den NFs herrschte auch in NT2N Zellen vor, da SMI32 hauptsächlich das Soma und proximale Anteile der Fortsätze

färbte. Die Unterschiede in der Verteilung von NL6 und SMI32 sind deutlich in der Abbildung 3.5 (unten) zu erkennen. NL6 färbt den langen Fortsatz eines Neurons (Pfeil), dessen Soma sich rechts außerhalb des Blickfeldes befindet. Dieser Zellausläufer wird von SMI32 nur schwach und nur im proximalen Bereich detektiert, woraus geschlossen werden kann, dass es sich um ein Axon handelt.

Siehe Abbildungen 1

Abb. 3.6: Immunfluoreszenzaufnahmen von NT2N Zellen. NT2N Zellen wurden nach siebenwöchiger Differenzierung auf Kollagen-beschichtete Deckgläschen ausplattiert und vier Tage später fixiert. Die Zellen wurden mit NL6 und αMAP2b doppelgefärbt und mit dem konventionellen Immunfluoreszenzmikroskop analysiert. Die Photos wurden mit einer AxioCam MRC Kamera von Zeiss aufgenommen. Maßstabsbalken entspricht 20 µm.

Des Weiteren wurde mit einem Kompartiment-spezifischen αMAP2b Antikörper doppelgefärbt. MAP2b ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, dass in adulten Neuronen im somatodendritischen Kompartiment angereichert ist. In der Abbildung 3.6 ist zu erkennen, dass MAP2b im gesamten Soma und den Dendriten aber nur im proximalen Teil des Axons (Pfeil) detektiert wird, während NL6 auch im distalen Axon vorhanden ist.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das NL6 Antigen in NT2N Zellen in allen Zellausläufern relativ gleichmäßig verteilt ist. Eine Kompartiment-spezifische Lokalisation, die darauf schließen lassen würde, dass der NL6 Antikörper nur eine spezifisch verteilte Subpopulation von NF-M detektiert, ist nicht zu erkennen.