Etablierung und Durchführung der kompetitiven RT-PCR

Der Vorteil der PCR als Untersuchungsmethode besteht darin, dass bereits kleine Mengen an RNA durch die reverse Transkription und die anschließende Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert und nachgewiesen werden können. Durch die Amplifikation eines Standards können Artefakt-Probleme bei der Quantifizierung der PCR-Produkte vermieden werden. Die Methode der kompetitiven RT-PCR basiert auf der Zugabe von einer exogenen Sequenz, die zu jeder Probe in einer cRNA-Form zugegeben wird. Diese hergestellte Sequenz ist eine verkürzte cDNA des

gewünschten PCR-Produkts und besitzt dessen Primer-Sequenz.

Durch die vorherige Bestimmung der Konzentration des eingesetzten Standards ist die Messung der absoluten Menge der nativen Sequenz ebenso wie die Messung der relativen Veränderungen in Versuchsgruppen möglich. Mit einer Titrationskurve kann man diejenige Menge der „mutanten“ cRNA bestimmen, die in der RT-PCR eingesetzt werden muss, um ein äquivalentes Signal aus einer definierten Menge totaler RNA aus einer biologischen Probe zu erhalten.

Die kompetitive RT-PCR wurde auch für ER β, GnRH-R, LH β und FSH β

durchgeführt und in Abbildung 16 zusammengefasst.

Abb. 16: Zusammenfassung der etablierten kompetitiven RT-PCR von 1: ER α, 2: ER β, 3 und 4: GnRH-R sowie 5: FSH β. M: 100 pb DNA-Längenstandard (helle Bande:

600 bp).

Nativer Sequenz M 1 M 2 M 3 4 M 5

„Mutanter“

Sequenz

4. Ergebnisse 79 4.5.2 Etablierung der Real-Time Taqman® PCR für GAD65, GAD67 und

GnRH

Die Real-Time Taqman® PCR (Applied Biosystems GmbH, BRD) ermöglicht es, PCR-Produkte zu amplifizieren und gleichzeitig die amplifizierte Menge an DNA quantitativ nachzuweisen (Lee et al., 1993). Bei diesem System hybridisiert jedoch während der PCR eine fluorogene Sonde mit den Primern zusammen am Matrizenstrang. In der Extensionsphase der PCR-Reaktion „verdrängt“ die AmpliTaq DNA Polymerase® die Sonde und lässt dadurch eine Y-förmige Sekundärstruktur entstehen, wodurch die 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq DNA Polymerase® induziert wird. Die Sonde wird somit abgetrennt und hydrolysiert.

Freie, nicht-hybridisierte Sonden werden hingegen nicht hydrolysiert. Die Hydrolyse der Sonde führt zur Abspaltung eines an diese Sonde gekoppelten fluoreszierenden Farbstoffs, der durch einen Sequenz-Detektor gemessen werden kann.

Entsprechend der Akkumulation des PCR-Produkts steigt die Fluoreszenz also mit jedem PCR-Zyklus an. Auf diese Weise ist es möglich, an der Stärke des spezifischen Fluoreszenzsignals die Akkumulation der PCR-Produkte abzulesen.

Diese Methode der PCR-Durchführung erfordert also keine post-PCR Auswertung per Gel-Elektrophorese und es sind auch keine Mutanten (kompetitive RT-PCR) oder House-Keeping-Genes (Semiquantitative RT-PCR) notwendig, um eine Vergleichsgröße zu erhalten und damit die Ergebnisse zu standardisieren.

Als Referenz werden bei der Taqman® PCR bekannte Mengen von Ziel-cDNA, die zuvor aus einer cRNA revers transkribiert wurden, als Standardkurve amplifiziert.

Die sogenannten CT-Werte werden in Abhängigkeit von der Standard-cDNA-Menge anhand des Auswertungsprogramms aufgetragen und dienen als Bezug für die Messwerte der Proben.

4.6 Die Expressionsveränderungen der untersuchten Gene auf der Ebene der hypothalamo-hypophysio-ovariellen Achse

Aus technischen Gründen konnte nicht immer die gleiche RNA Mengen aus den Tieren gewonnen werden. Daher konnte sich eine Abweichung der Zahl der Tiere innerhalb bestimmter Gruppen (n= x) in einigen Versuchsreihen ergeben.

4.6.1 Die präoptische Region des vorderen Hypothalamus (POA)

In der hypothalamischen Region POA (Perikarya der GnRH-Neurone) wurden die folgenden Gene, die für das GnRH-Netzwerk relevant sind und so eine wichtige Rolle bei den Alterungsprozessen spielen, untersucht: GAD65 und GAD67, GnRH und dessen Rezeptor (GnRH–R), ER α sowie ER β.

Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde bei der Messung der Konzentration von GAD65 – und GAD67 –mRNA keine signifikanten Veränderungen in der POA des Rattenmodells beobachtet. Ebenso wurden im Vergleich zu den jungen Tieren (Y13-Gruppe und Y17-(Y13-Gruppe) keine Änderungen in deren analogen (Y13-Gruppen (MA 13:00 +P und MA 17:00 +P) detektiert.

4. Ergebnisse 81

Abb. 17: Genexpression von GAD₆₅ der POA des Rattenmodells. In dieser und allen folgenden Abbildungen sind die Mittelwerte der densitometrischen Werte der Kontrollgruppe gleich 100 % ± SEM gesetzt. Die hier und in den übrigen Abbildungen des Kapitels verwandten Abkürzungen entsprechen denen in Abbildung 13.

Abb. 18: Genexpression von GAD67 in der POA des Rattenmodells.

Die Expression von GnRH und dessen Rezeptor, der GnRH-R, in der POA blieben auf dem Niveau der Kontrollgruppe. Die Vergleiche mit den jungen Tieren behielten insignifikante Veränderungen bei (Abb. 19 und Abb. 20).

POA

Abb. 19: Die Expression des GnRH in der POA des Rattenmodells.

POA

Abb. 20: Die Expression des GnRH-R in der POA des Rattenmodells.

4. Ergebnisse 83

In der POA des untersuchten Tiermodells wurden keine Veränderungen der Expression von ER α beobachtet (Abb. 21).

POA

Im Gegensatz zu ER α -mRNA zeigte die ER β -mRNA (Abb. 22)eine signifikante Absenkung um 34% in den responding Tieren (66 ± 13) sowie um 34% in deren analoger Gruppe der jungen Tiere der 17 Uhr-Gruppe (66 ± 13,7).

POA

Abb. 22: Die Expression des ER β in der POA des Rattenmodells.

*: p< 0,05 vs. Kontrolltiere.

4. Ergebnisse 85 Die Ergebnisse der untersuchten Gene in der POA sind in der Tabelle IV zusammengefasst.

Regulation der untersuchten Gene in der POA im Vergleich zu den Kontrolltieren

GAD₆₅ GAD₆₇ GnRH GnRH-R ER α ER β

MA 10:00 100% 100% 100% 100% 100% 100%

MA 13:00 –P

MA 13:00 +P

MA 17:00 –P

MA17 +P/LH ≥ 0

MA17 +P/LH ≤ 5

MA17 +P/LH ≥ 5

-

34%

Y 13:00

Y 17:00

-

34%

Tab. IV: Zusammenfassung der untersuchten Gene in der POA des Rattenmodells.

: Keine signifikante Änderung.

+ : Signifikante Erhöhung der mRNA-Menge - : Signifikante Abnahme der mRNA-Menge

4.6.2 Der mediobasale Hypothalamus

Folgende, für die Alterungsprozesse relevante Gene wurden im mediobasalen Hypothalamus (MBH), in dem sich die Axone der GnRH-Neurone befinden, auf Veränderungen im Tiermodell untersucht: GAD65 und GAD67, GnRH-Rezeptor (GnRH-R), ER α sowie ER β.

Die mRNA-Transkripte von GAD65 und GAD67 sanken gleicherweise bei der Y17:00-Gruppe um ungefähr 15% ab (Abb. 23 und Abb. 24).

MBH

Abb. 23: Die Expression des GAD₆₅ im MBH des Rattenmodells.

*: p< 0,05 vs. Kontrolltiere.

4. Ergebnisse 87

Abb. 24: Die Expression des GAD₆₇ im MBH des Rattenmodells.

*: p< 0,05 vs. Kontrolltiere.

Bei der Messung von GnRH-R-mRNA-Konzentrationen im MBH wurde bei der Y13-Gruppe eine Absenkung von 30% (70 ± 10.70) festgestellt. Diese Abweichung gegenüber der dazu analogen Gruppe MA13:00 +P zeichnete sich durch eine Erhöhung der MA13:00 +P um 70% aus.

Eine signifikante Absenkung der ER α -mRNA-Werte wurde im MBH nur in den beiden jungen Tieren beobachtet (Abb. 26). Die restlichen Gruppen blieben auf dem Kontrollniveau. Die Abnahme der Werte war bei der Y17-Gruppe (58% ± 8) deutlicher als bei der Y13-Gruppe (77% ± 10). Der Unterschied zwischen der Y17-Gruppe und den analogen mittelalten Y17-Gruppen war eindeutig und signifikant.

MBH

Abb. 25: Die Expression des GnRH-R im MBH des Rattenmodells.

*: p< 0,05 vs. Kontrolltiere.

9

: p< 0,05 vs. dazugehörige analoge Gruppe.

MBH

*: p< 0,05 vs. Kontrolltiere.

9

: p< 0,05 vs. dazu gehörige analoge Gruppe.

Die ER β-Expression zeigte eine Veränderung nur bei der Y17-Gruppe (Abb. 27).

Dabei sank die Expression um 25.5% (74,5 ± 8,5) ab. Diese Absenkung machte einen Unterschied zu der analogen responding-Gruppe kenntlich.

4. Ergebnisse 89 MBH

ERβ

Con 10 :00 n=18

MA13:00 n=22

MA13

:00 +P/LH- n=17 MA17:00 -P/

LH- n=19 MA17 +P

n=35

MA1 7 +P/

LH≤5 n=2 0

MA17

+P/LH≥5 n=15

Y 13:00 n=16 Y 17

:00 n=

18 0

25 50 75 100 125 150

*

*

ERβ -Transkript in %

Abb. 27: Die Expression des ER β im MBH des Rattenmodells.

*: p> 0,05 vs. Kontrolltiere.

9

: p> 0,05 vs. dazu gehörige analoge Gruppe.

Die Werte der untersuchten Gene im MBH sind in Tabelle V dargestellt.

Regulation der untersuchten Gene im MBH im Vergleich zu den Kontrolltieren

GAD₆₅ GAD₆₇ GnRH-R ER α ER β

MA 10:00 100% 100% 100% 100% 100%

MA 13:00 –P

MA 13:00 +P +

9

MA 17:00 –P

MA17 +P/LH ≥ 0

MA17 +P/LH ≤ 5

MA17 +P/LH ≥ 5 +

9

₊

9

Y 13:00 - 30 % - 23 %

Y 17:00 - 15 % - 15 % - 42 % -25,5%

Tab. V: Zusammenfassung der untersuchten Gene im MBH des Rattenmodells : Keine signifikante Änderung.

-

9

^{bzw. +}

9

: Ab- bzw. Anstieg vs. dazugehörige analogen Gruppe.

+ : Signifikante Erhöhung der mRNA-Menge - : Signifikante Abnahme der mRNA-Menge

4.6.3 Die Hypophyse

Die Expression der folgenden Gene wurde in der Hypophyse untersucht: Der GnRH-Rezeptor (GnRH–R), ER α sowie ER β und die β Untereinheiten von LH und FSH (LH-β und FSH-β).

Im Zusammenhang mit der GnRH-R-Genexpression bei den non-responding Tieren wurde eine Absenkung (63% ± 13,7) in der Hypophyse festgestellt. Die gesamte

4. Ergebnisse 91 behandelte Tiergruppe zeigte mit der Abnahme von 32% (68 ± 11,7) ein ähnliches Expressionsmuster. Die restlichen, gemessenen Veränderungen in den anderen Gruppen waren insignifikant (Abb. 28). Gegenüber der analogen Y17:00-Gruppe wurde ebenfalls eine Absenkung bei den behandelten Tiergruppen erkennbar.

Hypophyse

Abb. 28: Die Expression des GnRH-R in der Hypophyse des Rattenmodells.

*: p< 0,05 vs. Kontrolltiere.

9

: p< 0,05 vs. dazugehörige analoge Gruppe.

In der MA13:00 +P-Gruppe und deren analoger Gruppe, der Y13-Gruppe, wurde eine Expressionserhöhung von ER α gemessen (Abb. 29). Dieser Expressionsanstieg wurde bei den mittelalten Tieren auf 155% (155 ± 25) gemessen. Eine erhebliche Zunahme wurde bei der Y13-Gruppe (253% ±48) gemessen. Die restlichen Gruppen blieben auf dem Niveau der Kontrollgruppe.

Hypophyse

Abb. 29: Die Expression des ER α in der Hypophyse des Rattenmodells.

*: p< 0,05 vs. Kontrolltiere.

Im Gegensatz zu ER α zeigten die ER β-mRNA-Konzentrationsrate eine Absenkung in der Hypophyse (Abb. 30). Die mRNA-Konzentration sanken in der responding Tiergruppe (56% ± 17,3) und deren analogen Y17-Gruppe (56,6% ± 16). Bei den Transkript-Werten von ER β in den restlichen Gruppen wurde keine signifikante Veränderung gemessen.

4. Ergebnisse 93

Abb. 30: Die Expression des ER β in der Hypophyse des Rattenmodells.

*: p< 0,05 vs. Kontrolltiere.

Signifikante Erhöhungen der Transkripte der β-Untereinheit von FSH wurden in der Hypophyse beobachtet (Abb. 31). Die mRNA-Werte von FSH-β nahmen bei der responding Tiergruppe (296% ± 53) sowie deren analogen Y17-Gruppen (293% ± 45) zu. Die gesamten, behandelten Tiere zeigten auch eine Erhöhung der FSH-β mRNA-Konzentration (238% ± 42). Auch bei der non-responding Tiergruppe stieg das mRNA-Niveau (191,5% ± 30). Desweiteren dazu wurde eine leichtere Erhöhung (146% ± 20,8) bei der jungen Y13-Gruppe beobachtet. Eine Zunahme der Transkripte bei der MA13:00 +P (analog zu Y13) blieb jedoch insignifikant.

Aus technischen Gründen konnte leider die Methode der kompetitiven RT-PCR zur Messung der Genexpression von LH β nicht etabliert wurden. Zahlreiche Versuche wurden unternommen, um diese Methode für LH β zu optimieren, die jedoch nicht erfolgreich waren.

Hypophyse FSH-ß

Con 10 :00 n=18

MA13:00 n=24

MA13:00

+P/LH- n=18

MA17:00 -P/LH- n=20 MA17 +P

n=

36

MA17 +P/LH

≤ 5 n

=20

MA17

+P/LH≥ 5 n=16 Y 13

:00 n=16 Y 17:00 n=18 0

50 100 150 200 250 300 350

400

* *

*

* *

FSH-β -Transkript in %

Abb. 31: Die Expression des FSH-β in der Hypophyse des Rattenmodells.

*: p< 0,05 vs. Kontrolltiere.

4. Ergebnisse 95 Die Ergebnisse der untersuchten Gene in der Hypophyse des Rattenmodells sind in der Tabelle VI aufgelistet.

Regulation der untersuchten Gene in der Hypophyse im Vergleich zu den Kontrolltieren

GnRH-R ER α ER β FSH-β LH-β

MA 10:00 100% 100% 100% 100% 100%

MA 13:00 –P

MA 13:00 +P + 155%

MA 17:00 –P

MA17 +P/LH ≥ 0 + 238%

MA17 +P/LH ≤ 5 + 191,5%

MA17 +P/LH ≥ 5 -

9

+ 253% - 56 % + 296%

Y 13:00

Y 17:00 - 46,6 % + 293%

Tab. VI: Zusammenfassung der untersuchten Gene in der Hypophyse des Rattenmodells

: Keine signifikante Änderung.

-

9

bzw. +

9

: Ab- bzw. Anstieg vs. dazugehörige analogen Gruppe.

+ : Signifikante Erhöhung der mRNA-Menge - : Signifikante Abnahme der mRNA-Menge

4.6.4 Das Ovar

Im Ovar wurden die folgenden Gene, die für die Alterungsprozesse relevant sind, auf Veränderungen im Rattenmodell untersucht: GnRH, GnRH-R, ER α und ER β.

Die Expression von GnRH und dessen Rezeptor, GnRH-R, zeigte keine signifikante Veränderung in allen untersuchten Gruppen (Abb. 32 und Abb. 33).

Ovar

Abb. 32: Die Expression des GnRH im Ovar des Rattenmodells.

Die ER α -mRNA-Konzentrationen im Ovar blieben bei allen Tiergruppen des Modells auf dem Niveau der Kontrollgruppe (Abb. 34).

4. Ergebnisse 97

Abb. 33: Die Expression des GnRH-R im Ovar des Rattenmodells.

Ovar

Abb. 34: Die Expression des ER α im Ovar des Rattenmodells.

Im Gegensatz zu den ER α wurde bei den ER β Transkript-Werten eine Absenkung gemessen (Abb. 35). Die Expression von ER β sank bei den responding Tieren auf 68,3% (68,3 ± 12) im Vergleich zur Kontrollgruppe ab. Die dazu analoge Y17-Gruppe verzeichnete auch eine signifikante Absenkung der ER β -Expression (73,3%

± 12,5).

Ovar

Abb. 35: Die Expression des ER β im Ovar des Rattenmodells.

4. Ergebnisse 99 Die im Ovar untersuchten Gene sind in der Tabelle VII zusammengefasst.

Regulation der untersuchten Gene im Ovar im Vergleich zu den Kontrolltieren

GnRH GnRH-R ER α ER β

MA 10:00 100% 100% 100% 100%

MA 13:00 –P

MA 13:00 +P

MA 17:00 –P

MA17 +P/LH ≥ 0

MA17 +P/LH ≤ 5

MA17 +P/LH ≥ 5 - 68,3%

Y 13:00

Y 17:00 - 73,3%

Tab. VII: Zusammenfassung der untersuchten Gene im Ovar des Rattenmodells.

: Keine signifikante Änderung.

+ : Signifikante Erhöhung der mRNA-Menge - : Signifikante Abnahme der mRNA-Menge

5. Diskussion

Die charakteristische Pulsatilität der hypothalamischen GnRH-Neurone ist eine unabdingbare Vorrausetzung für die Funktion des hypothalamo-hypophysio-gonadalen Regelkreises. Da die GnRH-Neurone zahlreiche hypothalamische und extrahypothalamische Afferenzen erhalten, wurde für dieses neuronale Netzwerk der Begriff „Pulsgenerator“ geprägt. Frequenz und Amplitude der GnRH-Freisetzung werden direkt bzw. indirekt durch viele Substanzen beeinflusst. Eines dieser Produkte ist der Neurotransmitter GABA, der - neben seiner Rolle als

„Vermittler“ des Estrogen-Einflusses auf die GnRH-Neurone - auf die Regulation der GnRH-Sekretion inhibitorisch wirkt. Altersabhängige Veränderungen in der Regulation des GnRH-Netzwerks tragen zum reproduktiven Altern bei.

Hypothalamische Aktivitätsveränderungen der GABA-ergen Neurone während des Alters könnten daher als ein wichtiger Teil einer Kaskade, die zum Erliegen des reproduktiven Zyklus führen, sein. Das Rattenmodell hat sich als geeignet erwiesen, Studien zur Untersuchung des GnRH-Netzwerks und der Alterungsprozesse des Reproduktionssystems durchzuführen: In dieser Spezies sind die in der POA gelegene Perikarya der GnRH-Neurone von der Terminalienebene im MBH räumlich weit getrennt (Pellegrino et al., 1979). Dadurch bietet sich die Möglichkeit, die beiden Regionen auf getrennten Ebenen zu untersuchen. Analoge Veränderungen in der Estradiol-, FSH- und LH-Sekretion sowie auch des LH-Peaks treten während des Alters auch bei Menschen auf, was im folgender Text diskutiert werden soll.

5.1 Die Wirkung von Steroiden auf die GABA-erge Aktivität

Der Neurotransmitters Gamma-Amino-Buttersäure ist ein wichtiger Bestandteil des Netzwerks und von wesentlicher Bedeutung bei der Regulation des GnRH-Pulsgenerators: Maßgeblich ist in diesem zusammhang vor allem seine inhibitorische Wirkung auf die GnRH-Sekretion (Hood & Schwartz, 2000; Hiruma et al., 1994; Lee

& Pelletier 1993; Akema & Kimura, 1992; Bergen et al., 1991; Jarry et al., 1991;

Jarry et al., 1988) sowie seine Bedeutung als „Eintrittspforte“ für die negative/positive Rückkopplung des Estradiols (Übersicht bei Herbison 1998).

5. Diskussion 101 Die altersabhängigen Prozesse der Reproduktionsfunktion werden durch Veränderungen im hypothalamischen GnRH-Netzwerk hervorgerufen. Zu diesen Veränderungen tragen auch die GABA-ergen Neurone während des Alters aktiv bei.

Die Aussage beruht auf der Beobachtung, dass im Vergleich von 22 Monate alten die persistent östrischen Ratten und 4 Monate alten Ratten, die einen normalen östrischen Zyklus zeigten, eine Abnahme der Freisetzungsrate von GABA in der preoptischen Region der alten Ratten beschrieben wurde (Jarry et al., 1999). Diese Rolle des GABA-ergen Systems bei Alterungsprozessen der Reproduktion wurde ebenso von Herman und Larson (2001) bekräftigt. Sie beobachteten eine signifikante Zunahme der Expression von GAD65 mRNA in der medialen preoptischen Region der alten Ratten (30Monate alt), die mit jungen Ratten (3 Monate bzw. 15 Monate alt) verglichen wurden. Die altersabhängigen Veränderungen im Hypothalamus und im zentralen Nervensystem führen generell zu deutlichen Änderungen der Steroid-Spiegel (Klein et al., 1996a; Santoro et al., 1996; Nass et al., 1984; Wise, 1984). Die Steroide wiederum regulieren die Freisetzung (Jarry et al., 1992; Fleischmann et al., 1992) und Wiederaufnahme von GABA (Luine et al., 1999; Etchegoyen & Del Zotto, 1996) sowie auch die Expression von GAD (Kornbach & Grattan, 2001;

Majdoubi et al., 2000; Herbison et al., 1998) erheblich.

5.1.1 Methodische Aspekte der RNA-Quantifizierung

Für das Verständnis der spezifischen Regulation der GABA-Synthese unter dem Einfluss von Steroiden ist es notwendig, die RNA-Spiegel von GAD65 und GAD67, beides Isoformen des Enzyms Glutamat Decarboxylase, in definierten Zellpopulationen des Gehirns zu messen. Im Hinblick auf die Sensibilität hat sich die Methode der in situ Hybridisierung als beste Methode zum Nachweis und zur Lokalisierung zellulärer Gentranskripte in Geweben erwiesen (Park et al., 1990;

Shivers et al., 1986). Andere quantitative Methoden wie Northern Blot und der Ribonuklease-Protektion-Assay sind nicht sensitiv genug für den Nachweis der geringen mRNA-Mengen eines Genes, die etwa aus hypothalamischen Geweben eines Gehirns isoliert werden. Um einen Messwert zu erhalten, müssen mehrere RNA-Proben mehrer Tiere einer Behandlungsgruppe zusammen analysiert werden (Lee et al., 1990), so dass Aussagen zu Veränderungen in individuellen Tieren nicht

möglich sind. Andere quantitativen Methoden wie quantitativer reversen Transkription mit anschließender Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und wie die quantitativen Real-Time RT-PCR, sind extrem sensitiv, erlauben jedoch eine Aussage über die Veränderung der Genexpression in einem Hirnareal, nicht aber auf zellulärer Ebene.

In der vorliegenden Arbeit wurden diese beiden Methoden, in situ Hybridisierung und RT-PCR, für zwei spezifische Fragestellungen des GABA-ergen Systems verwendet. Beide Techniken haben sich, wie nun folgt diskutiert als geeignet zu der gestellten Fragen erwiesen.

5.1.2 Die Verteilung von GAD65 und GAD67 im GnRH-Netzwerk

In fast allen GABA-ergen Neuronen des Ratengehirns werden die beiden Isoformen der GAD expremiert. Die preoptische Region (POA) ist die wichtigste Region im GnRH-Netzwerk. Die Perikarya der GnRH-Neurone sind in der POA lokalisiert. Zu diesen Neuronen bestehen direkte synaptische Verbindungen mit GABA-ergen Neuronen (Léránth et al., 1988). Durch Doppelmarkierung mit in situ Hybridisierung wurde gezeigt, dass die GnRH-Neurone in der POA GABA-Rezeptoren besitzen (Peterson et al., 1993). Die POA ist an verschiedenen Regulationen von zahlreichen autonomen und neuroendokrinen Funktionen beteiligt. Ebenso wichtig ist der Nukleus suprachiasmaticus (SCN). Der SCN ist der zirkadianisch Haupttaktgeber bei den Mammalien. In jungen Ratten werden in dem SCN täglich neurochemische Signale erzeugt, die sich auf die GnRH-Neuronen richten und den richtigen Zeitpunkt des preovulatorischen LH-Surges hervorrufen (Van der Beek et al., 1997;

Harney et al., 1996). Im SCN ist GABA der überwiegende Neurotransmitter (Moore und Speh, 1993). Von den beiden Isoformen der GAD in der POA und im SCN wurden bei der in situ Hybridisierung stärkere Signale für GAD65 als für GAD67

gemessen (Feldblum et al., 1993; Escalpez et al., 1993; Escalpez et al., 1994).

Im Gegensatz zu der POA und SCN ist die Expression von GAD65 und GAD67 im mediobasalen Hypothalamus (MBH) der Ratte gleich (Feldblum et al., 1993). Die Axone der GnRH-Neurone liegen im posterioren mediobasalen Hypothalamus (PMBH), in der Eminentia mediana. Dort interagiert die GABA präsynaptisch mit den GnRH-Terminalen. Diese Interaktion wurde in jüngster Zeit durch

molekular-5. Diskussion 103 biologische Studie eindeutig belegt (Bilger et al., 2001).

Im Hippocampus konnte durch doppelt-in situ Hybridisierung gezeigt werden, dass in Sektoren der CA1 und CA3 stärkere Signale für GAD67 als für GAD65 gemessen werden (Stone et al., 1999; Houser und Esclapez, 1994). Im Gyrus dentatus ist GAD67 ebenfalls der dominante Subtyp der GAD (Feldblum et al., 1993). Die hippocampale Formation gehört zum limibischen System. In ihr werden Lernen, Sexualverhalten und Stresseinflüsse verarbeitet. Interessanterweise expremiert der Hippocampus reichlich GnRH-Rezeptoren (Jennes und Conn, 1994) und enthält ebenso neuronale Verbindungen zu den subcorticalen GABA-ergen Netzwerken bis hin zu der medialen preoptischen Region (Herman et al., 1995; Cullinan et al., 1993). Dies deutet darauf hin, dass die hippocampale Formation am GnRH-Netzwerk beteiligt sein könnte.

5.1.3 Die männliche Ratte als Tiermodell

Um das Expressionsmuster von GAD65 und GAD67 unter Einfluss von gonadalen Steroiden in der POA, im SCN, im MBH und im Hippocampus zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit das männliche Rattenmodell gewählt, das gegenüber der weiblichen Ratte eines konstanten endokrinen Zustand durch Ausschluss von Einflüssen des Östrus-Zyklus bietet.

In mehreren Studien wurde berichtet, dass endogene Veränderungen der ovariellen Steroid-Sekretion während des Östrus-Zyklus die Expression von GAD65 und GAD67

beeinflussen. Herbison et al. (1992) konnte eine 40%ige Reduktion der GAD67

mRNA in der MPOA während des Proöstrus (15:00 h) beobachten. Ähnliche Abnahme der GAD67 mRNA wurden im diagonalen Band von Broca des Organum Vasculosums der Lamina terminalis (DBB(ovlt) gemessen (Grattan et al., 1996).

Diese Beobachtungen wurden durch Verminderungen der GABA-ergen Aktivität in der MPOA während des Estrogen-induzierten GnRH-Peaks in ovariektomierten Ratten (Leonhardt et al., 2000; Seltzer und Donoso, 1992; Jarry et al., 1992; Jarry et al., 1988; Demling et al., 1985) und anderen Spezies (Wagner et al., 2001) bestätigt.

5.1.4 Effekte von Testosteron im Vergleich zu Estradiol und Gonadektomie auf die GABA-Expression innerhalb des GnRH-Netzwerks

Um die Einflüsse der einzelnen Steroide auf die GABA-erge Aktivität studieren zu können, mussten zunächst die steroidalen Rückkopplungsmechanismen ausgeschaltet werden. Dies ist allerdings nur in Studien mit gonadektomierten Individuen möglich.

Für die Wirkung von Estradiol bzw. von Testosteron wurden gonadektomierte Tiere mit Estradiol (3,5 µg/Tier) oder Testosteron (3,5 mg/Tier) behandelt.

In männlichen Säugern wird der Hauptanteil des eigenen Estradiols aus Testosteron transformiert. Dies geschieht durch eine Umwandlung der androgenischen Struktur von Testosteron durch Aromatase in einer aromatischen Ringkonfiguration von Estrogenen. Solche Aromatesierungsprozesse finden in Zielorganen statt. Im Gehirn von Nagetieren ist Aromatase relativ weit verbreitet insbesondere in Regionen, die

In männlichen Säugern wird der Hauptanteil des eigenen Estradiols aus Testosteron transformiert. Dies geschieht durch eine Umwandlung der androgenischen Struktur von Testosteron durch Aromatase in einer aromatischen Ringkonfiguration von Estrogenen. Solche Aromatesierungsprozesse finden in Zielorganen statt. Im Gehirn von Nagetieren ist Aromatase relativ weit verbreitet insbesondere in Regionen, die

Im Dokument Molekularbiologische Untersuchungen zu zentralnervösen Alterungsprozessen der Reproduktionsfunktion in der weiblichen Ratte (Seite 87-0)