Molekulargenetische Untersuchung von quantitativen Merkmalsgenorten für Osteochondrose beim Hannoverschen Warmblut
Claudia Dierks geb. Böneker
Einleitung
Die Osteochondrose (OC) ist eine Jungtiererkrankung, die bei mehreren Haustierpezies auftritt und beim Pferd eine der wichtigsten degenerativen Erkrankungen des Bewegungsapparats darstellt. OC ist durch eine Störung der enchondralen Ossifikation im Wachstumsknorpel der Gelenkoberfläche und der Epiphysenfugen charakterisiert. Eine derartige Ossifikationsstörung kann in verschiedenen Gelenken auftreten (Fessel-, Sprung-, Knie-, Schulter-, Hüft- und Wirbelgelenke), am häufigsten sind jedoch Fessel-, Sprung- und Kniegelenke betroffen. Die Ossifikationsstörung ist durch das Ausbleiben der Mineralisation und der Gefäßeinsprossung charakterisiert. Aufgrund dieser Störung kommt es zu einer Retention von hypertrophiertem Wachstumsknorpel, der schließlich in Gestalt eines Knorpelkerns die Primärläsion darstellt. Aus dieser Primärläsion, die auch als Chondrodysplasie bezeichnet wird, können bei weiterer Belastung Veränderungen im Sinne einer Osteochondrose hervorgehen. Typische Anzeichen einer Osteochondrose sind subchondrale Frakturen, subchondrale Knochenzysten, Knorpelusuren, Chondromalacia und Knorpelschuppen. Sind freie Knorpel-/Knochenfragmente im Gelenk vorhanden, wird die Erkrankung als Osteochondrosis dissecans (OCD) bezeichnet. Synoviitiden können als Begleiterscheinung auftreten.
Diese Veränderungen können sich weiter zu degenerativen Gelenkerkrankungen wie zum Beispiel Osteoarthrosis entwickeln. Sind Wirbelgelenke betroffen, kann es zum sogenannten Wobbler Syndrom kommen. Je nach Schwere der Erkrankung kommt es bei den betroffenen Tieren zu Leistungseinbußen. Schwerwiegende osteochondrotische Veränderungen im Zusammenhang mit klinischen Symptomen wie Gelenkschwellung, Lahmheit und Schmerzen können langfristig zum Verlust des Tieres führen.
Zahlreiche Studien belegen, dass die Prävalenz von Osteochondrose in verschieden Pferdepopulationen (v.a. Traber und Warmblutpferde) bis zu 79,5 % betragen kann.
Die Ursachen für die Entstehung der Osteochondrose sind zurzeit noch nicht bekannt. Man geht von einem multifaktoriellen Geschehen aus, in dem Skelettwachstumsraten, Ernährung, hormonelle Einflüsse sowie Traumata eine Rolle spielen. Heritabilitätsschätzungen in verschiedenen Studien haben gezeigt, dass auch eine genetische Komponente an der Entstehung der Erkrankung maßgeblich beteiligt sein muss. Mittels Segregationsanalysen wurde gezeigt, dass ein Hauptgen für Osteochondrose beim Schwein verantwortlich ist.
In einer früheren Studie beim Hannoverschen Warmblut wurden bereits Quantitative Trait Loci (QTL) für Osteochondrose identifiziert. Das Ziel dieser Dissertation ist es, die für OC kausalen Genorte mittels einer Erweiterung des Genomscans einzugrenzen und mit weiteren neu entwickelten Markern in den mit OC gekoppelten Genomregionen für OC verantwortliche Gene zu identifizieren. Da mittels vergleichender Genkarten zum Menschen Genombereiche des Pferdes wesentlich schneller aufgeklärt werden können, wurden für eine bislang wenig untersuchte Genomregion, in der ein für OC kausaler Genort lokalisiert wurde, die vergleichenden Genkarten zwischen Pferd und Mensch verfeinert. Damit sollten positionelle Kandidatengene identifiziert werden, um diese gezielt auf ihre Kausalität für OC untersuchen zu können.
Identifizierung von Quantitative Trait Loci über einen Genomscan
Material und Methoden
Pedigreematerial
Im Rahmen der Röntgenuntersuchung wurden insgesamt 629 Fohlen der Rasse Hannoversches Warmblut und deren Mütter auf OC bzw. OCD in den Fessel-, Sprung- und Kniegelenken untersucht. Die Untersuchung der Fessel- und Kniegelenke erfolgte durch lateromediale Aufnahmen, für die Sprunggelenke wurden plantolaterale-dorsomediale Aufnahmen gewählt. 403 Fohlen (64,1 %) zeigten weder Veränderungen im Sinne einer OC noch einer OCD. 118 Fohlen (18,8 %) waren OCD positiv, 108 Fohlen (17,2 %) OC positiv.
Zusammenfassung
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Für die vorliegende Studie wurden Familien mit der höchsten Anzahl an von OC betroffenen Nachkommen ausgewählt. Von den 629 geröntgten Fohlen wurden insgesamt 104 Fohlen mit den dazugehörigen Müttern in die Untersuchung einbezogen. Diese 104 Tiere verteilten sich auf 14 paternale Halbgeschwisterfamilien. Für acht der 14 Familien waren Blutproben für die Hengste vorhanden. Der Phänotyp der Hengste war nicht bekannt. Die Größe der Familien bewegte sich zwischen 3 und 20 Nachkommen. Die durchschnittliche Nachkommenanzahl betrug 7,4. 68,3% der Fohlen wurden als Zweijährige ein zweites Mal geröntgt, um die Entwicklung der röntgenologischen Befunde beurteilen zu können. Das Durchschnittsalter der Fohlen lag bei 6,3 Monaten zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung und bei 24,2 Monaten zum Zeitpunkt der zweiten Untersuchung. 73,1% aller Fohlen waren von OC betroffen, 45,2% waren von OCD betroffen und 26,9% waren frei von OC. Es wurden nur Tiere als OC frei eingestuft, die sowohl beim ersten als auch beim zweiten Röntgen keine Befunde aufwiesen.
Das Verhältnis der Geschlechter war ausgewogen.
Genomscan
Für den erweiterten Genomscan über alle equinen Autosomen und das X-Chromosom wurden insgesamt 157 Mikrosatellitenmarker aus veröffentlichten Markerkarten, vorwiegend aus der INRA Pferdekarte (http://locus.jouy.inra.fr/cgi-bin/lgbc/mapping/common/intro2.pl?BASE=horse), ausgewählt. Der durchschnittliche Markerabstand sollte 20 cM nicht überschreiten. Alle Mikrosatellitenmarker wurden über PCR und Polyacrylamidgelelektrophorese ausgewertet. Zur weiteren Abklärung und zum Ausschluss falsch positiver Ergebnisse wurden insgesamt 61 zusätzliche Mikrosatellitenmarker in den Regionen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p <
0.10 für den LOD-Score an dem Familienmaterial genotypisiert.
Kopplungsanalyse
Die nicht-parametrische Kopplungsanalyse wurde unter Verwendung der Software MERLIN (multipoint engine for rapid likelihood inference, Version 0.10.2) durchgeführt und basierte auf dem "identical-by-descent" (IBD) Verfahren (Abecasis et al., 2002). In dem sogenannten "Pairs" Modus (paarweiser Vergleich mit gleichmäßiger Gewichtung der betroffenen Tiere) wurden die Markerallele immer
zwischen Paaren von Geschwistern bzw. Verwandten auf Kosegregation mit der phänotypischen Ausprägung der Erkrankung getestet. Darauf folgend wurde die einer Normalverteilung folgende Teststatistik für den Anteil von IBD-Markerallelen (Zmean) und ein daraus abgeleiteter LOD-Score berechnet. Als signifikant für die Kosegregation eines Markerallels mit dem Phänotyp der OC gelten Irrtumswahrscheinlichkeiten (p) von 0,05 oder kleiner. Für die Merkmale OC, OCD, OC im Fesselgelenk, OCD im Fesselgelenk, OC im Sprunggelenk und OCD im Sprunggelenk wurden getrennte Berechnungen durchgeführt.
Ergebnisse
Das aus 218 Mikrosatelliten bestehende erweiterte Markerset zeichnete sich durch eine durchschnittliche Allelanzahl von 6,2, einen mittleren Heterozygotiegrad von 65,0% und einen durchschnittlichen PIC-Wert von 47,6 % aus. 73,9% aller Marker hatten einen größeren PIC-Wert als 50%. Bei nur 10 Markern lag der PIC-Wert unter 25%. Durch die nicht-parametrische Kopplungsanalyse wurden 19 chromosomenweit signifikante genomische Regionen für OC identifiziert, bei denen entweder der Zmean oder der LODscore signifikant waren. Diese QTL verteilten sich auf insgesamt 17 verschiedene Pferdechromosomen: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24 und 30. QTL für OC/OCD im Fesselgelenk waren überwiegend auf anderen Chromosomen lokalisiert wie QTL für OC/OCD im Sprunggelenk. Ein QTL auf dem Pferdechromosom 2 zwischen 27 und 42 cM erreichte für das Merkmal OC im Fesselgelenk genomweite Signifikanz für beide Teststatistiken.
Diskussion
Die Ergebnisse der Kopplungsstudie erbrachten den Nachweis von QTL für OC und OCD beim Hannoverschen Warmblut. Die Identifizierung von zahlreichen QTL deutet auf eine Beteiligung mehrerer Gene an der Entstehung der OC beim Pferd hin.
Trotzdem war es nicht möglich, Rückschlüsse auf die Vererbung von OC mit Hilfe eines einzelnen QTL zu ziehen. Auch war es nicht möglich, zu bestimmen, inwieweit die einzelnen QTL sich gegenseitig beeinflussen. Die Lage der identifizierten QTL legt nahe, dass OC/OCD in den Fesselgelenken von anderen Genen determiniert
Zusammenfassung
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wird als OC/OCD in den Tarsalgelenken. Die gefundenen QTL sollten im Folgenden durch eine Erhöhung der Markerdichte in diesen Bereichen auf 1-2 cM weiter eingegrenzt werden. Dafür mussten neue hochinformative Marker wie Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) entwickelt werden. Mittlerweile gibt es zahlreiche EST (Expressed sequence Tag)- Sequenzen für das Pferd in den Datenbanken, die mit Hilfe von BLAST (Basic Local Alignment Search Tool/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/HsBlast.html) menschlichen Genen zugeordnet werden können. Anhand bereits existierender vergleichender Genkarten für das Pferd konnten ESTs in den mit OC gekoppelten Genomregionen ausgewählt werden, um in diesen Sequenzen nach SNPs zu suchen.
Verfeinerung der Physikalischen Karten des Pferdes mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Radiation Hybrid (RH)-Kartierung
Material und Methoden
Isolierung von equinen genomischen BAC-Klonen
Für die Isolierung von equinen, genomischen BAC- (bacterial artificial chromosome) Klonen wurden mit 32P markierte, humane IMAGE cDNA Sonden verwendet. Die cDNA IMAGE Klone wurden vom RZPD (German Human Resource Center/Primary Database) bezogen. Für die Suche nach den orthologen equinen Genen wurden die Filter der equinen genomischen CHORI-241 BAC-Genbank verwendet. Nur bei positiven Signalen für die Sonde wurde die genomische equine BAC-DNA für die weitere Bearbeitung bezogen.
Nach Isolierung der equinen BAC-DNA wurde über eine Pulsfeldgelelektrophorese zunächst die Größe der equinen genomischen DNA-Fragmente bestimmt. Die 3’- und 5’-Enden der BAC-Klone wurden auf einem automatischen Sequenziergerät (LI-COR 4300) ansequenziert. Nach Maskierung repetitiver Elemente mit dem Repeat Masker Programm (http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker) wurden die Randsequenzen mit Datenbankeinträgen über das Programm BLASTN verglichen.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung wurde an pokeweed-mitogen-stimulierten Blutlymphozyten eines gesunden Pferdes auf GTG-gebänderten Metaphasechromosomen durchgeführt. Die Präparation der Metaphasen erfolgte nach zytogenetischen Standardtechniken. Vor der Hybridisierung wurden die GTG-gebänderten Chromosomen digital fotografiert. Die DNA der BAC-Klone wurde über Nick-Translation mit Digoxygenin markiert und auf den gebänderten equinen Chromosomen hybridisiert. Als Kompetitor-DNA zum Binden repetitiver Sequenzen der markierten Klone, wurden gescherte genomische equine DNA und Lachssperma-DNA eingesetzt. Unter Verwendung des Digoxigenin-FITC Detektionskit bzw. des Rhodamin Detektionskit wurden die Signale der hybridisierten Proben erfasst. Die Chromosomen wurden mit DAPI gegengefärbt und in Propidiumjodid/Antifade bzw.
Vectashield Mounting Medium eingebettet. Mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops wurden die Metaphasechromosomen auf Signale überprüft.
Radiation hybrid (RH) Kartierung
Die RH Kartierung war notwendig, um die zum Menschen vergleichende Genkarte zu verbessern und die Positionen der neu entwickelten Marker aus den Genombereichen, die signifikant mit OC gekoppelt sind, zu bestimmen. Die Verfeinerung der vergleichenden Genkarte war von besonderer Bedeutung, da in den bisher veröffentlichten RH-Karten die Synteniebeziehungen zwischen Pferd und Mensch sowie die Eingrenzung der Bruchpunkte nicht ausreichend genau waren. Für die Kartierung der aus dem Genomscan resultierenden OC-Genomregionen auf den Pferdechromosomen 2 und 4 wurden insgesamt 13 bereits kartierte Mikrosatellitenmarker und 60 BAC-Randsequenzen bzw. EST-Sequenzen aus den entsprechenden Regionen ausgewählt. Aus den Randsequenzen der Klone und EST Sequenzen für das Pferd wurden Primer entwickelt, die über PCR an den Zelllinien des equinen 5,000 rad Texas A&M University RH Panels typisiert wurden. Die Auswertung erfolgte durch Zwei-Punkt-Analysen mit 861 equinen Markern, die bereits durch Chowdhary et al. 2003 kartiert wurden. Dazu wurde der RHMAPPER-1.22 (http://equine.cvm.tamu.edu/cgi-bin/ecarhmapper.cgi) verwendet. Mit Hilfe des RHMAP3.0 Softwarepakets wurden Zwei-Punkt-Analysen (RH2PT) und Mehr-Punkt-Analysen (RHMINBRK und RHMAXLIK) durchgeführt.
Zusammenfassung
187 Kandidatengenauswahl
In den zu zwei ausgewählten genomischen OC-Regionen der Chromosomen 2 und 4 des Pferdes syntenischen menschlichen Genombereichen wurden insgesamt 8 Kandidatengene aufgrund ihrer Position ausgewählt. 5 dieser Gene könnten aufgrund ihrer Funktion oder Expression mit dem Erscheinungsbild der OC in Zusammenhang stehen. Drei dieser Gene kodieren für Kollagene, eines kodiert für ein Knorpelmatrixprotein und ein weiteres ist in von Nebenschilddrüsenhormonen gesteuerte Prozesse im Knochen involviert. Im Einzelnen waren dies die folgenden Gene: COL8A2 (Collagen, type VIII, alpha 2), COL16A1 (Collagen, type XVI, alpha 1), COL9A2 (Collagen, type IX, alpha 2), MATN1 (Matrilin 1, Cartilage Matrix Protein), SNX13 (sorting nexin 13), IMP-3 (IGF-II mRNA-binding protein 3), HIBADH (3-Hydroxyisobutyrate dehydrogenase) und B1 (Parathyroid hormone-responsive B1).
Subklonierung der BAC-DNA
Zwei BAC-Klone zu den Kandidatengenen COL9A2 und MATN1 auf Chromosom 2 des Pferdes wurden zur Subklonierung ausgewählt, um neue Pferdesequenzen zu generieren. Diese equinen BAC Klone wurden zur Subklonierung jeweils mit den Restriktionsenzymen Sac I und Xba I gespalten, anschließend in den pGEM4-Z Vektor ligiert und zur Kultivierung in kompetente XL1-blue E. coli transformiert. Aus den resultierenden Subklonen wurde die Plasmid-DNA isoliert und von beiden Rändern ansequenziert.
Generierung von neuen Pferdesequenzen
Die Randsequenzen der Subklone wurden mit dem Programm Sequencher 4.2 analysiert. Mit Hilfe des Programms BLAST konnten Subklone identifiziert werden, die Teile des COL9A2 bzw. des MATN1 Gens enthalten. Diese wurden mit einem automatischen Sequenziergerät LI-COR 4300 sequenziert und die erhaltenen Sequenzen mit dem Programm Sequencher 4.2 analysiert und zusammengefügt.
Sequenzprimer wurden mit Hilfe des Internetprogramms Primer3 entwickelt. Für das COL9A2 Gen war es möglich, die Lücken in der Sequenz durch Primer-Walking zu schließen. Die Exon/Introngrenzen wurden mit Hilfe des menschlichen COL9A2 Gens und bereits in Datenbanken verfügbaren Pferde-ESTs für dieses Gen
bestimmt. Weiterhin wurden repetitive Elemente mit dem Programm Repeatmaster 2, sowie der GC Gehalt mit der EBI toolbox CpG Plot/CpGreport ermittelt.
Ergebnisse
Die Kartierungsergebnisse für die Gene COL8A2, COL16A1, COL9A2, MATN1 SNX13, IMP-3, HIBADH und B1 entsprachen den Synteniebeziehungen zwischen Mensch und Pferd in den vergleichenden Genomkarten. Die Ergebnisse der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Das MATN1 Gen wurde nur über das RH-Panel kartiert, da es bereits von anderen Autoren mittels FISH kartiert wurde. Neben der Kartierung der Kandidatengene wurde eine umfassende vergleichende RH-Kartierung von insgesamt 42 Markern einer OC-Region auf dem Pferdechromosom 4 durchgeführt. Auf diese Weise konnte die Markerdichte der bisher publizierten komparativen Genkarten zwischen Mensch und Pferd deutlich erhöht und die Bestimmung der Bruchpunkte deutlich verfeinert werden. Dreizehn ausgewählte Gene konnten nicht in den OC-Genomregionen auf den Pferdechromosomen 2 und 4 kartiert werden, sondern wurden auf anderen Chromosomenabschnitten kartiert.
Tabelle 1 Ausgewählte Kandidatengene mit entsprechender humaner und equiner Lokalisation durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
Equines
Chromosom Gen Humane
Lokalisation
Equine Lokalisation
2 COL8A2 1p34.2 2p15-p16
2 COL16A1 1p35-p34 2p15.1-p15.3
2 COL9A2 1p33-p32 2p15-p16
4 SNX13 7p21.1 4q14
4 IMP-3 7p11 4q21.1-q21.3
4 HIBADH 7p15.2 4q21.1-q21.3
4 B1 7p14 4q21.3