Ermittlung geeigneter Versuchsbedingungen

4.2.1.1 Vergleich der Arabidopsis thaliana Ökotypen Columbia und Landsberg erecta Verschiedene Arabidopsis Ökotypen reagieren unterschiedlich auf Verticillium dahliae Infektion (Veronese et al., 2003). Der Ökotyp Landsberg erecta war im Vergleich zum Ökotypen Columbia geringfügig empfindlicher für V. dahliae. Dies zeigte sich zum Beispiel durch eine etwas stärkere Vergilbung von Blättern (Veronese et al., 2003).

Ob solche Unterschiede auch für die Infektion mit V. longisporum bestehen, ist nicht bekannt. Um dies zu prüfen wurden die beiden Ökotypen unter Verticillium longisporum Einfluss untersucht. Als Parameter wurden die Rosettenfläche, das Frischgewicht und der Chlorophyllgehalt gewählt. Der Infektionsverlauf wurde durch digitale Photos der einzelnen Pflanzen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Inokulation dokumentiert (Abb. 4.10A). Mit einer speziell entwickelten Software zur Blattflächenanalyse konnten die Bilder einzeln ausgewertet und die projizierte Rosettenfläche vermessen werden (siehe 3.3.6). In Abbildung 4.10A verdeutlichen exemplarische Photos zu verschiedenen Zeitpunkten nach Inokulation von mock und Verticillium-infizierten Arabidopsis Ökotypen Columbia und Landsberg erecta Symptome, die durch die Verticillium-Infektion hervorgerufen wurden, wie die Beeinflussung der Rosettengröße und Vergilbung. Die Analyse des Rosettenwachstums über einen zeitlichen Verlauf von 3 bis 35 Tagen, zeigte deutliche Unterschiede zwischen den Kontrollen der Ökotypen Columbia und Landsberg (Abb. 4.10B und C). Die Rosettenfläche der mock-inokulierten Landsberg-Pflanzen war zum Endzeitpunkt der Untersuchung mit durchschnittlich 50 cm² im Vergleich zu den mock-inokulierten Columbia Pflanzen mit durchschnittlich 76 cm² deutlich kleiner. Schon 14 Tage nach Inokulation war der Unterschied zwischen Rosettengrößen der Ökotypen Columbia und Landsberg signifikant.

In Abbildung 4.10B und 4.10C sind die Blattflächen der Rosetten von mock- und Verticillium-infizierten Arabidopsis im Vergleich dargestellt. Abbildung 4.10B zeigt den Einfluss von Verticillium longisporum auf die Rosettengröße des Ökotyps Columbia im Infektionsverlauf.

Ab 21 Tage nach Inokulation waren die Unterschiede zwischen den Blattflächen der Verticillium-inokulierten und der mock-inokulierten Pflanzen signifikant unterschiedlich. Zum gleichen Zeitpunkt zeigte sich auch beim Ökotypen Landsberg eine signifikante Reduktion der Blattfläche von Verticillium-inokulierten Pflanzen im Vergleich zu den mock-inokulierten Kontrollpflanzen (Abb. 4.10C).

Um zu prüfen, ob die durch V. longisporum verursachte Stauchung im Vergleich zur Kontrollbehandlung bei den beiden Ökotypen unterschiedlich stark ausgeprägt war, wurde die relative Stauchung als Verhältnis von VL43/mock bestimmt (Abb. 4.11). Diese Analyse ergab keine durch die Infektion hervorgerufenen Unterschiede zwischen den beiden Ökotypen.

A Col

Ler

Abb. 4.10: Entwicklung der Rosettenfläche im Infektionsverlauf. (A) Repräsentative Bilder der mock- und V. longisporum-inokulierten Arabidopsis Ökotypen Columbia (Col) und Landsberg erecta (Ler) zu verschiedenen Zeitpunkten nach Inokulation. Projizierte Blattfläche der Rosetten der Arabidopsis thaliana Ökotypen (B) Columbia (Col) und (C) Landsberg erecta (Ler). Zu jedem Zeitpunkt wurden n = 20 Photos pro Variante analysiert (± SE). Werte mit einem Stern waren beim Vergleich von mock (weiße Symbole) und V. longisporum inokulierten Arabidopsis (schwarze Symbole) im T-Test (p ≤ 0,05) signifikant unterschiedlich.

mock

Abb. 4.11: Stauchungsfaktoren (VL43/mock) der Arabidopsis Ökotypen Columbia (Col) und Landsberg (Ler) unter Einfluss von Verticillium longisporum (n = 20 ± SE) .

Weniger deutlich als bei der projizierten Blattflächenanalyse waren die Unterschiede zwischen den Ökotypen Columbia und Landsberg bei der Rosettenfrischmasse (Abb. 4.12).

Nach 35 Tagen Wachstum hatten die Rosetten von Columbia Kontrollpflanzen ein durchschnittliches Gewicht von 3,0 g und die von Landsberg 2,5 g. Dieser Unterschied war nicht signifikant.

Trotz früher eintretender Stauchung konnten erst am Versuchsende deutliche Veränderungen der Frischmasse nachgewiesen werden. Die Frischmasse der Verticillium-infizierten war im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollen beim Ökotyp Columbia 35 Tage nach Inokulation um 42 % reduziert, beim Ökotyp Landsberg bei 56 %. Die beiden Ökotypen waren nicht signifikant verschieden.

Abb. 4.12: Frischmasse der Rosetten im Infektionsverlauf. Die Rosettenfrischgewichte der Arabidopsis thaliana Ökotypen (A) Columbia (Col) und (B) Landsberg erecta (Ler) wurden zwischen 10 und 35 Tagen nach Inokulation bestimmt. Die Werte repräsentieren die Mittelwerte von jeweils 20 Pflanzen (± SE), aus zwei unabhängigen Experimenten. Werte mit einem Stern waren beim Vergleich von mock (weiße Symbole) und V. longisporum inokulierten Arabidopsis (schwarze Symbole) im T-Test (p ≤ 0,05) signifikant unterschiedlich.

10 15 20 25 30 35

Als weiterer Parameter zur Analyse der Symptomentwicklung der Arabidopsis thaliana Ökotypen Columbia und Landsberg unter Verticillium longisporum Einfluss diente der Chlorophyllgehalt. Die Messungen wurden über den gesamten Zeitraum bis 35 Tage nach Inokulation durchgeführt (Abb. 4.13). Ein Vergleich der mock-inokulierten Kontrollpflanzen der Ökotypen Landsberg und Columbia zeigte zunächst, dass die Chlorophyllgehalte der Kontrollen nicht verschieden waren, aber altersbedingt etwas abnahmen. Beide Ökotypen zeigten eine geringe, aber signifikante Abnahme des Chlorophyllgehalts in Verticillium-infizierten gegenüber mock-Verticillium-infizierten Pflanzen. 35 Tage nach Inokulation war der Chlorophyllgehalt des Ökotyps Columbia um 21 % und der des Ökotyps Landsberg erecta um 14 % gegenüber der jeweiligen Kontrolle gesunken.

Abb. 4.13: Chlorophyllgehalt in Blättern von mock- und Verticillium-inokulierten Arabidopsis thaliana im Infektionsverlauf. Der Chlorophyllgehalt der Blätter der Arabidopsis thaliana Ökotypen (A) Columbia (Col) und (B) Landsberg erecta (Ler) wurde spektrophotometrisch bestimmt und als Summe von Chlorophyll a und b dargestellt. Es wurden zwischen zwei und sieben Proben in Dreifachbestimmung analysiert (± SE). Werte mit einem Stern waren beim Vergleich von mock (weiße Symbole) und V. longisporum inokulierten Arabidopsis (schwarze Symbole) im T-Test (p ≤ 0,05) signifikant unterschiedlich.

Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Untersuchung, dass es zwar Unterschiede im Wachstum zwischen den beiden Ökotypen gab, aber im Hinblick auf Verticillium longisporum Infektion zeigte sich keiner der Ökotypen deutlich empfindlicher bzw.

resistenter. Für weitere Experimente wurde der Ökotyp Columbia ausgewählt, da er bei gleicher Symptomausprägung mehr Biomasse bildete.

4.2.1.2 Untersuchung des Arabidopsis thaliana Ökotyps Columbia unter Lang- und Kurztagsbedingungen

Die meisten in der Literatur beschriebenen Untersuchungen mit Verticillium-Pilzen an Arabidopsis thaliana wurden unter Langtagsbedingungen, d.h. 16 h Licht/8 h Dunkel Zyklus, durchgeführt (Steventon et al., 2001; Veronese et al., 2003). Unter diesen Bedingungen bleiben die Pflanzen relativ klein, da sie schnell die Blühreife erreichen. Da für die geplanten

10 15 20 25 30 35

Tage nach Inokulation ^{10 15 20 25 30 35}

*

Untersuchungen des Apoplasten relativ viel Biomasse erforderlich war, wurde das Wachstum des Ökotyps Columbia unter Lang- und Kurztagsbedingungen (8 h Licht/16 h Dunkel Zyklus) verglichen, um die optimalen Anzuchtbedingungen herauszufinden.

Die Analyse der projizierten Blattfläche über den Infektionsverlauf bis 27 Tage nach Inokulation zeigte eine deutliche Stauchung der Pflanzen unter Verticillium-Einfluss (Abb.

4.14). Diese Stauchung durch Verticillium-Infektion war unter Kurztagsbedingungen (Abb.

4.14A) wesentlich deutlicher als unter Langtagsbedingungen (Abb. 4.14B). Um zu prüfen, inwiefern die durch V. longisporum verursachte Stauchung relativ zur Kontrollbehandlung verändert war, wurde die Stauchung als Verhältnis von VL43/mock zum letzten Untersuchungszeitpunkt bestimmt. Unter Langtagsbedingungen betrug der Stauchungsfaktor 27 Tage nach Inokulation 0,64 ± 0,09 und unter Kurztagsbedingungen 0,26 ± 0,06. Dieser Unterschied war im T-Test signifikant (p = 0,0018).

Unter Langtagsbedingungen (Abb. 4.14B) zeigte sich in den ersten zwei Wochen nach Inokulation eine stärkere Zunahme der Blattfläche als unter Kurztagsbedingungen (Abb 4.14A). Danach nahm die Blattfläche unter Langtagsbedingungen kaum noch zu und betrug bei den mock-inokulierten Kontrollen nach 27 Tagen im Schnitt 12 cm² (Abb. 4.14B). Die Blattfläche der mock- inokulierten Arabidopsis unter Kurztagsbedingungen nahm zwischen 10 und 27 Tagen Wachstum deutlich zu und betrug beim Versuchsende durchschnittlich 23 cm² (Abb. 4.14A).

Eine Bonitur der Pflanzen ergab, dass alle unter Langtagsbedingungen gewachsenen Arabidopsis 7 Tage nach Inokulation Blütenansätze gebildet hatten. Unter Kurztagsbedingungen gewachsene Arabidopsis zeigten im gesamten Untersuchungszeitraum keine Blütenbildung.

Abb. 4.14: Entwicklung der Rosettenfläche im Infektionsverlauf bei Anzucht von Arabidopsis thaliana unter Kurztagsbedingungen (A) oder unter Langtagsbedingungen (B). Dargestellt ist jeweils der Mittelwert der projizierten Blattfläche durch Auswertung von Photos (n = 12 bis 27 ± SE). Werte mit einem Stern waren beim Vergleich von mock (weiße Symbole) und V. longisporum inokulierten Arabidopsis (schwarze Symbole) im T-Test (p ≤ 0,05) signifikant unterschiedlich.

0 5 10 15 20 25 30

Am Versuchsende wurden die Pflanzen geerntet und ihre Frischmasse bestimmt. Dabei ergab sich sowohl unter Lang- als auch unter Kurztagsbedingungen eine signifikante Reduktion der Frischmasse unter Verticillium-Einfluss (Abb. 4.15). Diese war aber unter Kurztagsbedingungen wesentlich ausgeprägter.

Abb. 4.15: Die Frischmasse der Arabidopsis thaliana Rosetten 28 Tage nach Inokulation. Die Säulen repräsentieren Mittelwerte von 12 bis 27 Pflanzen (± SE). Die Pflanzen waren unter Lang- bzw.

Kurztagsbedingungen gewachsen. Verschiedenen Buchstaben deuten auf signifikante Unterschiede hin.

Zusammenfassend gesehen, war die Biomasse unter Kurztagsbedingungen deutlich höher als unter Langtagsbedingungen. Die Verticillium-induzierte Reduktion der Rosettenfläche und der Frischmasse war unter Kurztagsbedingungen wesentlich stärker ausgeprägt als unter Langtagsbedingungen. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden für weiterführende Experimente Kurztagsbedingungen für die Anzucht von Arabidopsis thaliana gewählt.

4.2.2 Krankheitssymptome und Nährstoffversorgung von Arabidopsis thaliana im