2 Experimenteller Teil
3 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Analyse verschiedener Oberfl ächenmodi-fi zierungen hinsichtlich ihrer Bindungs-kapazität für Gliadin mit Hilfe der QCM Um verschiedene Oberfl ächenmodifi zierungen hinsicht-lich ihrer Bindungskapazität für Gliadin zu untersuchen, ist die Quarzmikrowaage eine geeignete Methode. Für die in Tab. 1 aufgeführten SAMs und Polyelektrolyten wurde die Bindungskapazität ermittelt. In Abb. 2 sind die Frequenzänderungen der Schwingquarze mit den einzelnen Oberfl ächenmodifi zierungen nach Applika-tion der Gliadin-Lösung dargestellt. Es wird deutlich, dass drei verschiedene Oberfl ächenmodifi zierungen in der Lage waren, Gliadin zu binden. Am effektivsten war der Polyelektrolyt PSS. Hier konnte eine Verringerung der Frequenz von ∆f = 95 Hz gemessen werden. Der Polyelek-trolyt PASA zeigte eine geringere Kapazität für Gliadin (Frequenzabnahme ∆f = 45 Hz), was möglicherweise an der geringeren Ladungsdichte des Polyelektrolyten lag.
Eine Oberfl ächenmodifi zierung mit SAMs aus 3-Mercap-topropionsäure zeigte ebenfalls eine deutliche Bindung von Gliadin. Die Frequenzabnahme des Schwingquarzes betrug ∆f = 71 Hz. Im Gegensatz dazu ergaben SAM-Oberfl ächen aus Mischungen verschiedener Thiole keine signifi kante Bindung.
Variation 3-MA PSH ESH PSS PASA
a 10 %
b 10 % 10 %
c 10 % 10 %
d 1 mg/ml
e 1 mg/ml
Tab. 1: Verschiedene Lösungen für die Modifi zierung der Gold ober-fl äche von Schwingquarzen, um anschließend darauf Gliadin zu binden. Alle Lösungen wurden mit destilliertem Wasser hergestellt, Prozentangaben beziehen sich auf das Volumen. Abkürzungen: 3-MA (3-Mercaptopropionsäure), PSH (Propanthiol), ESH (Ethanthiol), PSS (Polystyrensulfonsäure), PASA (Polyanilinsulfonsäure).
Nimmt man für Gliadin ein mittleres Molekulargewicht von 50 kDa an, so kann mit Hilfe der Sauerbrey-Gleichung [36] für die PSS-Schicht eine Oberfl ächenbelegung von ca.
13 pmol/cm2 berechnet werden. Hierbei muss jedoch be-rücksichtigt werden, dass die Sauerbrey-Gleichung keine Gültigkeit für fl üssige bzw. hydratisierte Verbindungen, wie gelöste Proteine, besitzt, so dass dieser Wert nur als Anhaltspunkt dienen kann. Trotz dieser Einschränkung hinsichtlich der quantitativen Werte ist die QCM aber eine geeignete Methode, um die verschiedenen Oberfl ä-chenmodifi kationen in Bezug auf ihre relative Bindungs-kapazität vergleichend zu untersuchen [37–38].
3.2 Nachweis von Antigliadin-Antikörpern durch Impedanzspektroskopie
Nach der Immobilisierung der Gliadine auf Goldsta-belektroden und anschließender Blockierung wurden diese als Biosensoren für den Nachweis und die Quanti-fi zierung der Antikörper eingesetzt. Die
Antikörper-Anti-gen-Bindung und die Peroxidase-katalysierte Oxidation von AEC resultiert in einer Änderung des isolierenden Charakters der Oberfl ächenmodifi zierung der Elektro-de. Diese Änderung kann durch EIS quantifi ziert wer-den. Nach den einzelnen Inkubationsschritten wurden Impedanzspektren in Anwesenheit des Redoxsystems [Fe(CN)6]3-/4- aufgenommen. Abb. 3 zeigt diese Spekt-ren für einen Biosensor auf PSS-Basis. Diese weisen für
PSS 3MA PASA 3MA/ESH 3MA/PSH
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -100
Abb 2: QCM-Analysen der Bindungskapazität für Gliadin an verschieden modifi zierten Goldoberfl ächen. Die Messungen wurden in einer selbstgebauten Fließzelle mit einem Volumen von ca.
30 μl durchgeführt (Abb. 1). Nachdem der in die Zelle eingebaute Schwingquarz mit Puffer 2 bis zur Einstellung einer Basislinie gespült worden war (Flussrate: 50 μl/min), wurde der Puffer durch eine Gliadinlösung (0.31 mg/ml) ersetzt. Nach der Applikation von ca. 500 μl der Gliadinlösung bei einer Flussrate von 50 μl/min wurde wieder zu Puffer 2 gewechselt. Jeder Wert repräsentiert den Durchschnitt von zwei analysierten Schwingquarzen mit der gleichen Oberfl ächenmodifi zierung. Beispielhaft zeigt das Inset die QCM-Kurve eines 3-MA-modifi zierten Schwingquarzes.
0 5 10 15 20 25
Impedanz Imaginär Teil (k
Ω
)Impedanz Real Teil (kΩ)
Abb. 3: Nyquist-Darstellung der Impedanzspektren nach den verschiedenen Inkubationsschritten der Testprozedur. Die Messkurven wurden in Puffer 2 in Anwesenheit von 2.5 mM [Fe(CN)6]3- und 2.5 mM [Fe(CN)6]4- innerhalb eines Frequenzbereichs von 0.5 Hz bis 50 kHz aufgenommen: (a) PSS modifi zierte Elektrode nach Gliadin-Bindung und BSA-Blockierung, (b) Biosensor nach der Inkubation mit Antigliadin-Antikörpern, (c) Biosensor nach der Inkubation mit dem POD-markierten Zweitantikörper, (d) Biosensor nach Oxidation von AEC durch die Peroxidase.
R/C-Parallelschaltkreise typische Halbkreise auf, welche den Elektronentransferprozess des Hexacyanoferrats an der Elektrodenoberfl äche widerspiegeln. Hierbei sind der Elektronentransferwiderstand (Rct) und die Dop-pelschichtkapazität (Cdl) die Elemente, welche die Ge-stalt der Halbkreise bestimmen. Aus der Abbildung wird deutlich, dass die Inkubation des Biosensors mit dem Antigliadin-Antikörper zu einer Widerstandszunahme führt. Die Bindung des POD-markierten Zweitantikör-pers bringt eine weitere, wenn auch kleine Erhöhung.
Eine sehr große Widerstandszunahme konnte dagegen nach der POD-katalysierten Oxidation von AEC und Nie-derschlagsbildung beobachtet werden. Biosensoren auf Basis eines SAMs aus 3-Mercaptopropionsäure zeigten ebenfalls eine Zunahme der Impedanz im Verlauf des As-says (nicht gezeigt). Im Vergleich zum PSS-Biosensor war die Widerstandszunahme jedoch etwas geringer. Um die Impedanzanalyse der Biosensoren zu vereinfachen, wur-de auch versucht, Messungen in Abwesenheit eines redo-xaktiven Stoffes durchzuführen (nur im Phosphatpuffer).
Beispielhaft dafür sind die Impedanzspektren eines Bio-sensors nach den verschiedenen Inkubationsschritten in Abb. 4 dargestellt. Im Vergleich zu den Messungen mit Redoxmediator resultieren aus der Analyse der Elektro-den wesentlich höheren Impedanzwerte. Diese waren ebenfalls nach der AEC-Oxidation am höchsten (Linie c), jedoch war die relative Zunahme im Verlauf des Assays wesentlich geringer. In diesen Experimenten musste auch festgestellt werden, dass eine Zunahme der Impe-danz in Kontrollexperimenten (Biosensoren, die nur mit dem POD-markierten Zweitantikörper und nicht mit dem Antigliadin-Antikörper behandelt worden waren) zu messen war. Aus diesen Gründen wurde bei weiteren Impedanzanalysen in Gegenwart des Hexacyanoferrat-Redoxsystems gemessen. Dieses Messschema sorgte für stabile und reproduzierbare Ergebnisse mit maximaler Signaländerung.
3.3 Auswertung der Impedanzspektren anhand eines Ersatzschaltbildes
Impedanzspektren werden mit Hilfe von Ersatzschalt-bildern quantitativ ausgewertet. Ein einfaches und sehr häufi g verwendetes Modell ist der Randles-Schaltkreis [39]. Dieser setzt sich aus den Elementen für den Lösungs-mittelwiderstand (Rsol), der Doppelschichtkapazität (Cdl) und dem Ladungstransferwiderstand (Rct) zusammen (Abb. 5). Mit Hilfe des Randles Ersatzschaltbildes wur-den das Spektrum des unbenutzten Biosensors (Inset in Abb. 5) und des Biosensors nach absolviertem Assay (Abb. 5) analysiert. Alternativ zur Doppelschichtkapa-zität wurde in den Randles-Schaltkreis ein konstantes Phasenelement (CPE) integriert. Abb. 5 macht deutlich, dass beide Verfahren eine zuverlässige Kurvenapproxi-mation des Spektrums zulassen und ähnliche Werte für den Ladungstransferwiderstand berechnen. Für den un-benutzten Biosensor ergibt das Randles-Ersatzschaltbild mit Doppelschichtkapazität einen Rct-Wert von 840 Ω während mit CPE 908 Ω berechnet werden. Nach der Assay-Prozedur wurden 23,2 kΩ für das Rct-Element im Ersatzschaltbild mit Cdl-Element und 24,2 kΩ für Rct im Ersatzschaltbild mit dem CPE-Element errechnet.
Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die kapaziti-ven Werte in beiden Ersatzschaltbildern (Cdl: 1.31 μF / CPE: 1.19 μF (unbenutzter Biosensor) und Cdl: 1.31 μF / CPE: 1.08 μF (Biosensor nach dem Assay) sich nur wenig unterscheiden. Dies wird auch durch den α-Faktor des CPE-Elements deutlich, der einen Wert nahe 1 besitzt
0 40 80
Abb. 4: Impedanzspektren eines auf 3-MA-Basis hergestellten Biosensors nach Messung in reinem Phosphatpuffer ohne Zugabe eines Redoxmediators: (a) 3-MA-modifizierte Elektrode nach Gliadin-Bindung und Aminoethanol-Blockierung, (b) Biosensor nach Inkubation mit dem POD-markierten Zweitantikörper, (c) Biosensor nach Oxidation von AEC durch die Peroxidase.
Abb. 5: Aufgenommene Impedanzspektren (▄) und anhand eines Randles-Ersatzschaltbildes gefi ttete Kurven eines PSS-basierten Biosensors nach der BSA-Blockierung (Inset) und nach AEC-Präzipitation. (∆) Werte anhand des Fits des Ersatzschaltbildes mit Doppelschichtkapazität (Cdl), (○) Werte anhand des Fits des Ersatzschaltbildes mit konstantem Phasenelement (CPE). Die Fit-Ergebnisse der Schaltbildelemente des Biosensors nach der BSA-Blockierung waren folgende: Ersatzschaltbild mit Cdl-Element;
Rsol = 95 Ω, Rct = 840 Ω, Cdl = 1.31 μF) und Ersatzschaltbild mit CPE-Element; Rsol = 88 Ω, Rct =908 Ω, CPE = 1.19 μF, α = 0.88. Fit-Ergebnisse der Schaltbildelemente des Biosensors nach Präzipitation:
Ersatzschaltbild mit Cdl-Element; Rsol = 10 Ω, Rct = 23.25 kΩ, Cdl =
0 200 400 600 800 1000 1200
0
(0.88 für den unbenutzten Biosensor und 0.93 für den Biosensor nach Assay-Prozedur) und somit für das CPE-Element eine nur geringfügige Abweichung gegenüber einer reinen Kapazität aufzeigt. Es wird also deutlich, dass die Verwendung eines CPE-Elements im Randles-Ersatzschaltbild keine signifi kante Verbesserung bietet.
Daher wurde für die weitere Auswertung der Impedanz-spektren ein Ersatzschaltbild mit Cdl-Element verwendet.
Bei dem Vergleich der Werte für die einzelnen Elemente vor dem Assay und danach konnte festgestellt werden, dass die kapazitiven Änderungen des Biosensors durch die Assay-Prozedur nur gering sind (1 - 5 %) und der Lö-sungsmittelwiderstand (wie erwartet) nicht durch die Antigen-Antikörper-Bindung beeinfl usst wird. Es konnte aber eine drastische Zunahme im Ladungstransferwi-derstand festgestellt werde, so dass der Wert für das Rct -Element als Sensorparameter genutzt werden konnte. Die Auswertung der Impedanzspektren eines Biosensors auf Basis einer SAM mit 3-Mercaptopropionsäure zeigte ein sehr ähnliches Ergebnis und bestätigte, dass eine zuver-lässige Auswertung der Spektren anhand eines Randles-Ersatzschaltbildes mit einem Cdl-Element möglich ist.
3.4 Kalibrierung des Biosensors
Die Verwendung von Goldelektroden als Biosensoren für die Analytik von Antikörpern sollte durch die Etab-lierung einer Kalibrationskurve und durch die Analyse verschiedener humaner Seren gezeigt werden. Aufgrund der einfachen und schnellen Präparation wurden hierzu Biosensoren auf Basis von PSS-modifi zierten Goldelek-troden verwendet. Eine Konzentrationsabhängigkeit des Sensorsignals von der Antikörperkonzentration konnte durch die Inkubation der Sensoren in Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen an Antigliadin-Anti-körpern demonstriert werden. Abb. 6 zeigt eine Kalib-rationskurve, in der die Rct-Werte nach POD-Reaktion gegen den Logarithmus der Antikörper-Konzentration aufgetragen wurden. Es wird deutlich, dass bei Antikör-perkonzentrationen im Bereich von 0,008 μM bis 1,5 μM eine Zunahme im Ladungstransferwiderstand festgestellt werden kann. Eine sigmoidale Kurvenapproximation nach Gleichung 1 [40] resultierte in einer halbmaxima-len Sättigung des Sensorsignals bei 0.613 μM. Die Kalib-rationskurve weist eine Korrelation mit den Messwerten von r2 = 0.96 auf. Das Detektionslimit des Biosensors kann mit ca. 100 nM angegeben werden.
(1)
A2 = maximaler Rct-Wert (1.64 x 106 Ohm) A1 = minimaler Rct-Wert (0.25 x 106 Ohm) x = Konzentration an Antigliadin Antikörpern
in der Probe (M)
x0 = Halbsättigung des Biosensors mit Antikörpern (0.613 μM)
y = Sensorparameter (Rct-Wert) der Probe (Ohm) p = Exponent (1.19)
Schließlich wurden fünf verschiedene humane Seren, die hinsichtlich ihrer Antigliadin-Antikörper-Konzentrati-on durch ELISA-Experimente eindeutig charakterisiert worden waren (Seramun Diagnostica GmbH, Wolzig), mit Hilfe des Biosensors analysiert. Von den fünf unter-suchten Seren waren zwei positiv auf Zöliakie (P1 und P2) und drei Seren negativ (N1 bis N3). Um zuverlässige diagnostische Ergebnisse zu bekommen, wurden diese Seren sowohl auf Antigliadin-Antikörper vom Immun-globulin Typ G als auch Typ A untersucht. Dies wird möglich durch die Verwendung unterschiedlicher POD-markierter Antikörper; einerseits gegen humane IgGs und andererseits gegen IgAs. Obwohl die Analytik von IgG-Molekülen einfacher und sensitiver ist, reicht eine alleinige Bestimmung von IgG-Antigliadin-Antikörpern nicht aus, da diese auch in anderen, ähnlichen Autoim-munerkrankungen vorkommen und daher ein positiver Befund nicht zwingend für Zöliakie wäre. Antikörper vom Typ IgA sind wesentlich spezifischer für die Zö-liakie, jedoch besitzen ca. 2 % der Zöliakie-Patienten einen angeborenen IgA-Mangel, der zu falsch negativen Befunden führen würde. Für eine sichere Diagnostik der Zöliakie ist daher die kombinierte Analytik von IgG- und IgA-Antigliadin-Antikörpern erforderlich. Hierdurch er-langt man eine Sensitivität von 96 % bis 100 % bei einer Spezifi tät von 96 % bis 97 % [41]. Um einen weiteren Ver-gleich zu den Sensor- Ergebnissen zu bekommen, wurden die Seren auch mit einem kommerziellen Testsystem (IMTEC-Gastro-LIA, Imtec, Berlin) analysiert.
Vor der EIS-Analyse wurden die verschieden Seren analog zu den ELISA-Experimenten verdünnt, um Rct -Werte zu erhalten, die innerhalb des linearen Teils der Kalibrationskurve liegen. Wie zu erwarten war, resultier-te die Analyse der Seren in höheren IgG Konzentrationen und niedrigeren IgA-Konzentrationen an Antigliadin-Antikörpern. Beide Typen von Immunglobulinen be-sitzen aber mikromolare Konzentrationen (Tab. 2). Die physiologische Konzentration dieser Antikörper im ge-sunden Menschen liegt bei ca. 90 μM für IgG- und bei ca. 22 μM für IgA-Antigliadin-Antikörper [42]. Aus der Abb. 6: Kalibrationskurve für Antigliadin-Antikörper: Auftragung des Ladungstransferwiderstandes nach der AEC-Präzipitation gegen den Logarithmus der Antikörperkonzentration (IgG). Jeder Datenpunkt entspricht dem Mittelwert der Messwerte von drei Biosensoren.
10-8 10-7 10-6
Tabelle wird also deutlich, dass die IgG-Werte für die Se-ren N2 und N3 nur ca. 50 % der Literaturangabe betragen, während N1 mit 210 μM einen vielfach höheren Wert besitzt. Die Konzentrationen für den IgA-Antigliadin-An-tikörper in den Seren N1 und N3 ist wiederum dreifach höher als in der Literatur angegeben. Hierbei ist aber zu berücksichtigen, dass die Kalibration nur als eine Annä-herung betrachtet werden kann, da keine kommerziellen IgA-Antigliadin-Antikörper verfügbar waren. Für die Konzentrationsbestimmung musste also auf die IgG-Ka-librationskurve zurückgegriffen werden. Trotz ähnlicher Molekulargewichte der Immunglobuline vom Typ IgG und IgA kommt es im Fall der IgA-Moleküle zur Aggre-gatbildungen, was die Bestimmung des Rct-Wertes stark beeinfl ussen kann [43]. Weiterhin ist zu berücksichtigen, dass für eine genaue Konzentrationsbestimmung der Autoantikörper Kalibrationskurven mit humanen An-tigliadin-Antikörpern hätten etabliert werden müssen.
Gereinigte humane Antigliadin-Antikörper-Lösungen mit Konzentrationsangaben sind jedoch bisher weder für den IgG- noch den IgA-Typ erhältlich.
Serum
-Tab 2: Ladungstransferwiderstände (Rct-Werte) und Antigliadin Antikörperkonzentrationen, die mit dem Biosensor für die verschiedenen Seren bestimmt werden konnten. Zum Vergleich sind auch die Ergebnisse der Analysen mit dem ELISA- und dem IMTEC-Test gezeigt.
Auch wenn gesicherte Antikörperkonzentrationen für die einzelnen Seren hier nicht angegeben werden kön-nen, kann doch mit diesem Biosensor eindeutig zwi-schen positiven und negativen Seren unterschieden werden. Das negative Serum N1 besitzt zwar im Vergleich zu N2 und N3 einen erhöhten IgG-Wert, trotzdem liegt dieser Wert noch unter den Werten für P1 und P2. In ELISA-Experimenten wurde dieses Serum zwar eindeutig als negativ bewertet, doch hängt dies stark davon ab, bei welcher Signalstärke der cut-off zwischen positiv und ne-gativ gesetzt wird. Der erhöhte IgG-Level (210 μM) kann auch von unterschiedlichen Verdünnungsfaktoren her-rühren. Die Verdünnung von komplexen Mischungen, wie humanen Seren, ist aufgrund von Ausdünnungsef-fekten störender Substanzen nicht nur für den Biosensor, sondern auch in ELISA-Analysen ein kritischer Punkt.
Betrachtet man die Konzentrationen der Antigliadin-Antikörper vom IgA-Typ, so fällt auf, dass nur das Serum P1 eine signifi kante Erhöhung aufweist, wogegen die Konzentrationen in P2, N1, N2 und N3 sehr ähnlich sind. Dies stimmt mit den ELISA-Ergebnissen überein.
Hier wird das Serum P2 als negativ hinsichtlich der IgA-Antikörper eingestuft. Ein Grund hierfür könnte der schon erwähnte physiologische IgA-Mangel sein, der zu falsch negativen Ergebnissen führen kann.
Die Analyse der Seren mit einem kommerziell er-hältlichen Test (IMTEC) zeigte für P1 einen positiven Befund hinsichtlich der IgG- als auch der IgA-Antikörper, wogegen P2 fälschlicherweise als negativ eingestuft wur-de. Negativ-Seren wurden richtigerweise auch als nega-tiv erkannt. Im Vergleich zum entwickelten Biosensor und dem ELISA erlaubt der IMTEC-Test nur eine Ja-/
Nein-Antwort und gibt keine Konzentrationsangaben.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass der ent-wickelte Biosensor eine zuverlässige Analytik für die Kon-zentrationsbestimmung von Antigliadin-Antikörpern in humanen Seren bietet.
4 Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde ein Biosensor für die Analytik von Antigliadin-Antikörpern im humanen Serum entwickelt.
Der Biosensor basiert auf Goldelektroden, die mit dem Polyelektrolyten PSS oder mit 3-Mercaptopropionsäure modifi ziert worden waren, um darauf das Antigen Glia-din zu koppeln. Im Anschluss an die Inkubation des Bio-sensors mit der Probe wurde zur Verstärkung des Antikör-per-Antigen-Signals ein zweiter Inkubationsschritt mit einem POD-markierten Antikörper und anschließender POD- katalysierter Oxidation von AEC durchgeführt. Der Zuwachs der Schichtdicke auf der Elektrodenoberfl äche im Verlauf des Sandwich-Assays führte zu einer Zunahme in der Impedanz der Elektrode. Diese Zunahme wurde durch EIS in Anwesenheit von Ferri-/Ferrocyanide ge-messen. Hierbei konnte der Ladungstransferwiderstand (Rct) als Sensorparameter identifi ziert werden. Es wurde eine Kalibrationskurve für Antigliadin-Antikörper etab-liert, in dem eine Korrelation zwischen Rct Werten und verschiedenen Antikörperkonzentrationen aufgestellt wurde. Mit Hilfe dieser Eichkurve konnte die Konzen-tration von Antigliadin-Antikörpern in verschiedenen humanen Seren bestimmt werden.
Danksagung
Diese Arbeit wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) (Projekt 03I1315C) ge-fördert. Die Autoren bedanken sich bei der Seramun Diag nostica GmbH für die freundliche und intensive Kooperation im Rahmen des Projektes.
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