Die Darstellung der Versuchsergebnisse erfordert die Abbildung von Kurvenschaaren. Die beschriebene Individualit ¨at der Kulturen f ¨uhrt zu, an den Mittelwerten gemessen, großen Standardabweichungen. Da die Fallzahl der hier vorgelegten Studie nicht sehr groß ist, sind die Ausreißer in der generellen Tendenz schwer kompensierbar. Die gew ¨ahlte Dar-stellung erlaubt sowohl das Ablesen von generellen Tendenzen, Mittelwerten und Stan-dardabweichungen, als auch die einfache Identifikation von Ausreißern.
Die Bewertung der Ergebnisse ist am ¨ubersichtlichsten nach Versuchsgruppen geglie-dert vorzunehmen. Die unter optimalen Kulturbedingungen gehaltene Versuchsgruppe A1 erf ¨ahrt w ¨ahrend des Versuchszeitraumes kaum gravierende Ver ¨anderungen. W ¨ahrend die Gesamtmenge an Protein leicht r ¨uckl ¨aufig ist, verhalten sich auch die Konzentratio-nen der beiden Sch ¨adigungsdetektoren LDH und AST r ¨uckl ¨aufig oder konstant. M ¨ogliche Gr ¨unde hierf ¨ur sind der initial ausges ¨ate Anteil nicht vitaler Zellen, sowie der Anteil der noch vitalen Zellen, die nicht adh ¨arent wurden und daraufhin zu Grunde gingen.
Durch die Mediumwechsel wird der auf das Konto dieser zwei Fraktionen gehende An-teil der Enzyme durch Auswaschung reduziert. Dies erkl ¨art den eher hohen
Ausgangs-KAPITEL 6. DISKUSSION
wert der Sch ¨adigungsparameter und die kontinuierliche Abnahme des AST-Spiegels. Die Ber ¨ucksichtigung der Syntheseparameter best ¨atigt diese Tendenzen. Die Harnstoffkon-zentrationen bleiben absolut gesehen auf einem hohen Niveau. Der Anteil freigesetzten Harnstoffs durch Zelltod w ¨are auch hier eine Erkl ¨arung f ¨ur die leichten Differenzen inner-halb der ersten Versuchsgruppe. Die produzierten Albuminmengen ver ¨andern sich nicht signifikant ¨uber die Zeit. Die numerische Zunahme des Mittelwertes deutet allerdings auf eine sich eher steigernde Produktionsleistung der Hepatozytenkulturen w ¨ahrend der ers-ten drei Tage hin. Der letzte in Betracht zu ziehende Parameter ist die Zellaktivit ¨at; auch hier ergibt sich das Bild einer eher regenerierenden Kultur. Die am Ende der Versuche an-gefertigten lichtmikroskospischen Bilder best ¨atigen die guten biochemischen Werte die-ser Gruppe.
Die zweite Versuchsgruppe ist mit der ersten direkt vergleichbar, einziger Unterschied war die Applikation von HLC1 Medium zwischen den ersten beiden Versuchszeitpunkten. Die daraus resultierenden Verluste an Gesamtprotein legen den Schluß nahe, dass in dem Kulturmedium essentielle Bestandteile zur normothermen Kultur von prim ¨aren humanen Hepatozyten fehlen. Eine Toxizit ¨at einiger Komponenten in der W ¨arme ist ebenfalls nicht auszuschließen, denn selbst w ¨ahrend der Rekultur mit William‘s E Medium ist abermals ein heftiges Zellsterben zu beobachten. Die parallel gemessenen Sch ¨adigungsparameter zeigen ein komplett differierendes Bild: Die eher zytosolisch anzutreffende Laktatdehy-drogenase erreicht unter der Inkubation mit HLC1 Medium an T2 einen Peak, der auch bei der in der K ¨alte mit HLC1 inkubierten Gruppe A4 nicht zu beobachten ist. Ein Anstieg der AST ist zu diesem Zeitpunkt nicht evident, es ist eine signifikante Abnahme zu ver-zeichnen. W ¨ahrend der Rekultur kehrt sich das Bild um. Eine Erkl ¨arung daf ¨ur mag sein, dass der Angriff der zweifelsfrei durch die Inkubation mit HLC1 Medium in der W ¨arme ausgel ¨osten Sch ¨adigung nicht im Bereich der Mitochondrien zu finden ist, die Mitochon-drien vielleicht sogar einen gewissen Schutz durch das Medium erfahren. Ein Hinweis darauf bieten die signifikant niedrigeren AST-Mengen an T2 gegen ¨uber der Gruppe A1.
Die in den AST-Konzentrationen erst am Ende des Versuchs nachvollziehbaren Sch ¨aden w ¨urden in diesem Modell dann w ¨ahrend der Rekultur mit William´s E Medium nur ih-ren Abschluss finden und w ¨aih-ren nicht als Folge der Rekultur zu verstehen. Der Verlauf der Syntheseparameter st ¨utzt diese Interpretation. Sowohl die freigesetzten Mengen an Harnstoff als auch an Albumin nehmen deutlich ab, allerdings ist dieser Verlust an Syn-thesekapazit ¨at nur zwischen den ersten Kontrollpunkten signifikant, f ¨ur den Zeitraum der Rekultur ergeben sich nicht signifikante ¨Anderungen der Mittelwerte. Leider liefert die Be-stimmung der Zellaktivit ¨at auf Grund der erw ¨ahnten HLC1-Testreagenz-Interaktion keine weiteren verwertbaren Aspekte. Nur die am Versuchsende deutliche Reduktion der Akti-vit ¨at im Vergleich zum Ausgangswert ist sichtbar und entspricht damit den mikroskopisch gewonnenen Eindr ¨ucken der Kultur.
Die zum Nachweis der maximalen Sch ¨adigung ohne Schutz in der K ¨alte inkubierte
Grup-KAPITEL 6. DISKUSSION
pe A3 erleidet einen nicht unerheblichen Schaden, der sowohl in der Betrachtung des Gesamtproteins als auch der AST deutlich wird. Am zweiten Kontrolltag hat diese Ver-suchsgruppe die niedrigsten Proteinmengen aller VerVer-suchsgruppen vorzuweisen. Dies ist gerade im Vergleich mit der anderen Kaltgruppe A4 nur durch bereits in der K ¨alte ab-laufende Sch ¨adigungsprozesse erkl ¨arbar. Mit dem Wissen um den Schutz von mitochon-drialen Membranpotentialen durch Eisenchelatoren und dem Auftreten der AST-Peaks in nahezu allen Kulturen der Versuchsgruppe muss eine die Mitochondrien einschließende Sch ¨adigung hier als Ursache angesehen werden. Dies spricht am ehesten f ¨ur einen ne-krotischen Untergang von Teilen der Kultur. Die LDH-Aktivit ¨aten zeigen ¨uberhaupt keine Ver ¨anderungen, dies ist vor dem Hintergrund des Ausmaßes der Zellsch ¨adigung nicht befriedigend erkl ¨arbar. Die signifikanten Einbußen in den Freisetzungen von Synthe-seprodukten (Harnstoff, Albumin) am Versuchsende deuten ebenfalls auf eine massive Sch ¨adigung dieser Versuchsgruppe in der K ¨alte hin. Anders als die zweite Versuchs-gruppe verf ¨allt die dritte Gruppe in der Rekulturphase nicht mehr so rapide weiter. Die nicht signifikante weitere Abnahme des Gesamtproteins, der signifikante R ¨uckgang der AST-Konzentration, sowie die zumindest konstant bleibenden Syntheseparameter bele-gen dies. Dieses Ergebnis ist etwas ¨uberraschend, da bei Rattenhepatozyten f ¨ur ver-gleichbare Zeitr ¨aume gezeigt werden konnte, dass die kalte Inkubation zwar f ¨ur die Ver-ursachung von Sch ¨adigungsketten verantwortlich ist, diese allerdings eher in der Pha-se der Wiedererw ¨armung zu beobachten sind.33 Die mikroskopischen Aufnahmen der Versuchsgruppe nach der Rekultur best ¨atigen den Eindruck einer deutlich gesch ¨adigten Kultur. Dieser Kulturverlauf wird aber auch von der gesch ¨utzten Kaltgruppe A4 teilwei-se best ¨atigt, was ebenso ¨uberrascht, da dies unter Anweteilwei-senheit der Eiteilwei-senchelatoren geschah. Das erst in der Phase der Wiedererw ¨armung signifikant sinkende Gesamtpro-tein und die steigende AST-Konzentration deuten den beschriebenen Ablauf an. Die sich nicht ver ¨andernden LDH-Konzentrationen und die vergleichsweise sehr gute Wiederher-stellung der Syntheseleistungen nach nahezu v ¨olligem K ¨altearrest relativieren das Bild.
Im Vergleich der Zellaktivit ¨at am Versuchsende ergeben sich allerdings deutliche Einbu-ßen f ¨ur beide Kaltgruppen gegen ¨uber der Warmkontrolle A1. Auffallend ist bei beiden kaltinkubierten Gruppen die fehlende Ver ¨anderung in den gemessenen LDH-Aktivit ¨aten, zumal die Bestimmung von AST in den Mediumproben Sch ¨aden anzeigt. Auch wenn man bedenkt, dass LDH nur zytosolische und AST sowohl zytosolische als auch mit-ochondriale Sch ¨aden detektiert, ist dies nicht befriedigend zu erkl ¨aren. Bei Rattenhepa-tozytenkulturen ist laut Rauen et al. die Bestimmung der Laktatdehydrogenase ein eta-bliertes Mittel, k ¨alteinduzierte Sch ¨adigung nachzuweisen. Die lichtmikroskopischen Bilder der gesch ¨utzten Kaltkultur A4 best ¨atigen im Vergleich mit derungesch ¨utzten Kaltkultur A3 den besseren Zustand der Kultur am Versuchsende. Nichtsdestotrotz ist der Unterschied in verschiedenen Parametern zur warminkubierten Standardkultur A1 un ¨ubersehbar.
Im Vergleich der Versuchsgruppen ist die Standardkultur A1 allen anderen Kulturen
KAPITEL 6. DISKUSSION
¨uberlegen. Ablaufende Sch ¨aden sind kaum erkennbar und leberspezifische Funktionen scheinen sich zu erholen. Allerdings ist bekannt, dass prim ¨are humane Hepatozyten unter Standardkulturbedingungen nach gut einer Woche in ihrer metabolischen Leistung stark reduziert sind. Die hier dargestellten guten Ergebnisse der Gruppe A1 sind als falsch positiver Einfluss der kurzen Inkubationsdauern zu verstehen. Die eigentliche Kaltver-suchsgruppe A4 zeigt sich zwar den anderen zwei Gruppen nicht zuletzt aufgrund der guten Ergebnisse in den Synthesefunktionen ¨uberlegen, f ¨allt aber in eben diesem Punkt, wie auch bei der Bestimmung des Gesamtproteins, gegen ¨uber der Standardkultur A1 leicht ab. Offensichtlich war der mitochondriale Sch ¨adigungsweg durch die Gabe der Ei-senchelatoren noch nicht gut genug abgedeckt. Die eventuelle Toxizit ¨at beziehungsweise ungen ¨ugende Austattung mit Stimulantien (Insulin) des HLC1 Mediums mag ebenso f ¨ur die nicht vollst ¨andige Erhaltung der Integrit ¨at dieser kaltinkubierten Zellen verantwortlich sein. In diesem Sinne scheint der Hauptadressat des Schutzmediums, n ¨amlich der per Wiedererw ¨armung auftretende radikalvermittelte Oxidationsprozess durch HLC1 Medium nur partiell verhinderbar zu sein, wobei die hier durchgef ¨uhrte Kaltinkubation mit 24 Stun-den eher kurz gew ¨ahlt ist.
In Bezug auf die anfangs formulierten Ziele dieser Studie ist festzustellen, dass durch die Applikation von eisenchelatorhaltigen Kulturmedien hypothermie-induzierte Sch ¨aden an prim ¨aren humanen Hepatozyten signifikant zu mildern sind. Die eigentliche Versuchs-gruppe A4 ist in einer globalen Beurteilung, nicht zuletzt aufgrund der guten Synthe-seleistungen am Kulturende, knapp hinter der warmen Kontrollgruppe A1 einzuordnen.
Es liegt nahe, dass bei l ¨angeren Kulturzeiten und einem optimierten K ¨alteschutzmedium eine ¨Uberlegenheit von kaltinkubierten Gruppen gegen ¨uber der warmen Kontrolle her-beif ¨uhrbar ist. Eine Verwendung des K ¨alteschutzmediums unter normothermen Bedin-gungen ist aufgrund der dargestellten Sch ¨adigung nicht erfolgversprechend.