37
IV Ergebnisse
1 Verwendbarkeit von FFPE Hodenmaterial
Aufgrund der schwankenden DNA-Qualität ist für die Identifizierung von klonalen TCR/IG-Genumlagerungen im PCR-Screening sowie für die quantitative Messung der TCR/IG-Genumlagerungen von Zellen aus fixiertem Hodengewebe ein einheitliches Vorgehen mit der extrahierten FFPE DNA notwendig. Zur Messung der DNA-Qualität stehen mehrere Verfahren zur Verfügung. Im Folgenden werden Ergebnisse der Qualitätsbestimmung der FFPE DNA am Lichtspektrometer Nano Drop 1000, durch die β-Globin-Referenzgenquantifizierung mittels Echt-Zeit-PCR und die Fragmentlängenbestimmung in einer Standard-PCR vorgestellt und daraus ein Fließschema zur Verwendbarkeit von FFPE DNA aus Hodengewebe hergeleitet.
1.1QUALITÄT DER FFPEDNA
Lichtspektrometer: Die oben beschriebene spektrophometrische Messung der Verunreinigung und Konzentration der DNA erwies sich für die Bestimmung der DNA-Qualität aus FFPE Hodengewebe (FFPE DNA) als alleinige Methode als nicht zielführend, da die gemessenen Werte mit den Ergebnissen der Quantifizierung des β-Globin Referenzgens mittels Echt-Zeit-PCR nicht übereinstimmten: Obwohl eine optimale OD260/OD280-Ratio von zirka 1,8 (±0,1) angezeigt und die Konzentration auf 100ng/µl (±30ng/µl) eingestellt wurde, war es vielfach nicht möglich, das β-Globin-Gen zu quantifizieren. Der Hintergrund für diese oft fälschlicherweise guten Messresultate im Spektrometer ist unklar, dürfte jedoch in Zusammenhang mit der Paraffin induzierten DNA-Verkettung stehen, die im Zuge der Paraffin-Lösung und DNA-Extraktion zu eine Zerstückelung der DNA-Stränge führt. Somit mäße der Spektrophometer kurze, unzusammenhängende DNA-Abschnitte, an denen eingesetzte Primer nicht binden können.
Quantifizierung des β-Globin Referenzgens mittels Echt-Zeit-PCR: Als weitere Methode wurde ein Genabschnitt (≈200bp lang) des β-Globin Genloci unter genannten Standardbedingungen der Echt-Zeit-PCR quantitativ gemessen. Diese DNA-Mengen-Bestimmung unter Berücksichtigung ihrer Amplifizierbarkeit wurde, wie oben beschrieben, mit allen DNA-Proben durchgeführt, um anschließend eine quantitative Aussage über die identifizierten Genumlagerungen treffen zu können. Aus der amplifizierbaren Menge lassen sich weitere Informationen über die DNA-Qualität schließen. Alle Messungen der DNA-Proben aus KM und frischem/gefrorenem Hoden zeichneten ein einheitliches Bild und wiesen in der Echt-Zeit-PCR einen CT-Wert auf, der stets zwischen denen der unverdünnten (100) und 1:10 (10-1) verdünnten Positivkontrolle (BC) lag.
Ein anderes Bild ergab sich bei der Auswertung der 18 verfügbaren FFPE DNA-Proben, deren
IV Ergebnisse
38
DNA-Messung im Lichtspektrometer den genannten Kriterien entsprach. Der gemessene β-Globin-Wert variierte extrem. Um inhibitorische Effekte, die die PCR-Reaktion durch die Formalin-Fixierung und Paraffin-Einbettung beeinflussen können, zu erkennen und abzuschwächen, wurden alle FFPE DNA-Proben jeweils in originaler Konzentration (im Spektrophometer gemessene 100ng/µl) und in Aqua destillatum 1:10 und 1:100 verdünnt gemessen. Dabei zeigte sich bei 12 von 18 Proben eine Inhibition, die falsch niedrige beziehungsweise falsch negative β-Globin-Werte in den unverdünnten Proben hervorbrachte.
Die logarithmische Abstufung der 1:100-Verdünnung entsprach dabei aber stets der mathematisch korrekten Folge der Verdünnungsreihe. Das heißt, dass der β-Globin-Wert der 1:10-Verdünnungen 10% der „wahren“ DNA-Mengen widerspiegelt. Das Balkendiagramm in Abbildung 4 zeigt die gemessenen β-Globin Werte der 18 FFPE DNA Proben. Die Balkenfarben beziehen sich auf das in Abbildung 6 gezeigte Fließschema und deuten die weitere Verwendbarkeit an. Tabelle 9 zeigt die gemessenen β-Globin-Werte der zwölf weiter verwendeten und analysierten Patienten, deren Amplifizierbarkeit des β-Globin-Gens mindestens 10-3 in der Echt-Zeit-PCR entsprach.
Abbildung 3: Amplifizierbarkeit des β-Globin-Referenzgens der FFPE DNA-Proben. An der Verteilung ist zu erkennen, dass unbekannte, molekulare Reaktionen die quantitative Messung des Referenzgens in unverdünnten Proben (linker Balken) behindern. Die Farben weisen auf die weitere Verwendbarkeit der DNA hin.
0 2 4 6 8 10 12
10-1 10-2 10-3 10-4 <10-4
Anzahl der FFPE DNA-Proben
Standardreihe des β-Globin-Referenzgens Legende zur Abbildung 3:
Jede FFPE DNA-Probe ist in der Abbildung in zwei Balken vertreten: Der jeweils linke Balken zeigt das Messergebnis der unverdünnten Probe, der jeweils rechte Balken das der 1:10 verdünnten Probe.
Grün: Proben zum PCR-Screening geeignet. Orange: Proben quantifizierbar. Rot: Proben nicht verwertbar.
10-1 10-2 10-3 10-4 <10-4
IV Ergebnisse
39
Tabelle 9: β-Globin-Amplifizierungsergebnisse der zwölf weiter analysierten FFPE DNA-Proben.
Amplifizierbarkeit des β-Globins Patienten unverdünnt 1:10 Verdünnung Inhibition
#10 10-4 10-2 +
#11 nicht messbar 10-2 +
#12 nicht messbar 10-1 +
#13 10-2 10-3 -
#14 nicht messbar 10-3 +
#15 10-1 10-2 -
#16 10-2 10-3 -
#17 10-2 10-2 +
#32 nicht messbar 10-1,5 +
#33 10-4 10-3 +
#34 nicht messbar 10-3 +
#35 10-2 10-2 +
β-Globin PCR zur Fragmentlängenbestimmung: Um die Integrität der DNA und damit die möglichen Fragmentlängen, die sicher ampilfiziert werden können, zu erfassen, wurden die in Tabelle 7 aufgelisteten Primer entworfen. Diese binden an die β-Globin Gensequenz und dienen der Amplifikation von Fragmenten unterschiedlicher Längen. Die PCR-Bedingungen entsprechen den für die TCR-α Familie in Tabelle 3 beschriebenen.
Tabelle 10: Entworfene Primer zur β-Globin Fragmentlängenbestimmung der extrahierten FFPE DNA
Element Genort Primer Sequenz Fragmentlänge
β-Globin 11p15 β-Globin forward 5´-CTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3´ (consensus) β-Globin reverse 100 5´-CCAACTTCATCCACGTTCAC-3´ 120bp β-Globin reverse 300 5´-CAAAGGACTCAAAGAACCTCTG-3´ 300bp β-Globin reverse 400 5´-CCATCACTAAAGGCACCG-3´ 400bp β-Globin reverse 600 5´-GTCTGTTTCCCATTCTAAACTG-3´ 600bp
Abbildung 4 zeigt das Ergebnis einer Gelelektrophorese (2%igen Agarose). Buffy Coat (BC) wurde als Positivkontrolle verwendet. Eindeutig erkennbar sind die positiven Banden bei unverdünntem BC (100ng DNA vor Amplifizierung eingesetzt) und bei einer 1:10 Verdünnung
IV Ergebnisse
des BCs (10ng DNA vor Amplifizierung eingesetzt). Die Nachweisg
Sensitivität der Methode ist bei einer Verdünnung der Positivkontrolle von 1:100 (1ng DNA vor Amplifizierung eingesetzt) überschritten
einer Länge von 300 und 400 Basenpaaren erkennbar Abbildung 4: Sensitivitätstest der
Aus diesem Sensitivitätstest folgt Globin-Gens entweder 10-1 in
den verdünnten Proben ergab, auf ihre Fragmentlängen getestet werden konnten. Dabei wurde unabhängig von vorhandener Inhibition
zeigte, dass der Einfluss der Inhibition nicht auf die Standard zeigt die Ergebnisse der
qualifizierten Patienten.
Tabelle 11: Amplifizierbare Fragmentlängen
die zuvor eine ausreichende Amplifizierbarkeit des aufwiesen.
Patient 120bp 300bp
#10 +
#11 +
#12 +
#15 +
#17 +
#32 +
#35 +
1.2SENSITIVITÄT DES STANDARD
Die im Standard-Screening verwendeten Primer wurden auf ihre Se den Einsatz von FFPE DNA im Standard
BC unverdünnt
40
des BCs (10ng DNA vor Amplifizierung eingesetzt). Die Nachweisg
Sensitivität der Methode ist bei einer Verdünnung der Positivkontrolle von 1:100 (1ng DNA vor überschritten. An dieser Stelle sind nur zwei schwache Banden mit einer Länge von 300 und 400 Basenpaaren erkennbar.
Sensitivitätstest der β-Globin Primer mit BC (Positivkontrolle)
Aus diesem Sensitivitätstest folgte, dass alle FFPE DNA-Proben, deren Amplifizierbarkeit des in verdünnten beziehungsweise unverdünnten Proben oder 10 ergab, auf ihre Fragmentlängen getestet werden konnten. Dabei wurde unabhängig von vorhandener Inhibition stets die unverdünnte Originallösung eingesetzt, da sich zeigte, dass der Einfluss der Inhibition nicht auf die Standard-PCR übertragbar ist.
der β-Globin PCRs zur Fragmentlängenbestimmung
Amplifizierbare Fragmentlängen (Standard-PCR) der sieben
eine ausreichende Amplifizierbarkeit des β-Globin-Gens in der Echt
Fragmentlänge
300bp 400bp 600bp
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
(+) - -
+ (+) -
+ + +
TANDARD-SCREENINGS
Screening verwendeten Primer wurden auf ihre Sensitivität hin getestet
DNA im Standard-Screening die erforderliche Amplifizierbarkeit zu
BC 10-1 BC 10-2
Legende (+)
des BCs (10ng DNA vor Amplifizierung eingesetzt). Die Nachweisgrenze und damit die Sensitivität der Methode ist bei einer Verdünnung der Positivkontrolle von 1:100 (1ng DNA vor . An dieser Stelle sind nur zwei schwache Banden mit
Globin Primer mit BC (Positivkontrolle)
Proben, deren Amplifizierbarkeit des β-verdünnten Proben oder 10-2 in ergab, auf ihre Fragmentlängen getestet werden konnten. Dabei wurde stets die unverdünnte Originallösung eingesetzt, da sich PCR übertragbar ist. Tabelle 11 zur Fragmentlängenbestimmung der sieben
sieben FFPE DNA-Proben, in der Echt-Zeit-PCR
vität hin getestet, um für g die erforderliche Amplifizierbarkeit zu
Legende zu Tabelle 11:
+ ≙ positiv
(+) ≙ schwach positiv - ≙ negativ
IV Ergebnisse
41
definieren. So wurde statt der Patientenproben eine Verdünnungsreihe der Positivkontrollen in BC von 100 bis 10-3 eingesetzt und nach den oben beschriebenen Standardbedingungen amplifiziert sowie mit der beschriebenen Agarose- und zur Homo-Heteroduplexanalyse verwendeten Polyakrylamid-Gelelektrophorese dargestellt. Die Ergebnisse fassen Tabellen 12 und 13 zusammen.
Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese inklusive der beschriebenen Silbernitratfärbung stellte sich im Vergleich zur Agarose-Gelelektrophorese als sensitiver heraus, positive DNA-Banden hervorzuheben. Die Banden der Rearrangement-Familien Ig κ, IG VHJH, IG DHJH und TCR γ waren im Agarose-Gel in vielen Fällen begleitet von einer „verschmierten“ BC-Bande. Je höher die Verdünnung, das heißt je weniger Positivkontrolle im Verhältnis zum BC in der eingesetzten Lösung war, desto geringer wurde der Unterschied zwischen einem fraglich positivem Ergebnis und der BC-Bande. Als Beispiel dient Abbildung 5.
Zusammengefasst beträgt die Sensitivität der Methode in den meisten Fällen 10-1. Einzel-PCR-Produkte haben eine höhere Nachweisgrenze als die der Multiplex. Eine Besonderheit bilden die TCR-Familien bei der Agarose-Gelelektrophorese. Hier sind zum Teil auch in den Einzel-PCRs nur unverdünnte Positivkontrollen eindeutig nachweisbar. Dahingegen zeugt die Nachweisbarkeit der 1:10-Verdünnungen unter Verwendung des Polyacrylamid-Gels für die Überlegenheit dieser aufwendigeren und kostenintensiveren Methode.
IV Ergebnisse
42
Rearrangement-Familie Rearranement 100 10-1 10-2 10-3 BC
Ig κ1 + + - -
-Ig κ2 + + - -
-Ig κ3 + + - -
-Ig κ4 + + - -
-Ig κi + + - -
-VH1/7 + ((+)) - -
-VH2 + (+) - -
-VH3 + + -
-VH4/6 + + - -
-VH5 + + - -
-VH6 + + ((+)) -
-DH1 + + ((+)) -
-DH2 + (+) - -
-DH3 + + -
-DH4 + (+) - -
-DH5 + + - -
-DH6 + + ((+)) -
-V2Jα54 + + + (+)
-V2Jα29, 48 + + + ((+))
-V2Jα9 + + (+) ((+))
-V2Jα30, 55, 58, 61 + + (+) -
-V2D3 + - - -
-V1JD12 + (+) - -
-V3JD12 + (+) - -
-D2D3 + (+) - -
-V2JD12 + (+) ((+)) -
-D2JD12 + - - -
-V3JD12 + + - -
-V2D3 + ((+)) - -
-V1JD12 + + (+) -
-D2D3 + + - -
-V2JD12 + (+) - -
-D2JD12 + + - -
-V1JG1/2 (+) - - -
-V11JG1/2 + (+) - -
-V9JG1/2 + - - -
-V10JG1/2 + - - -
-V1JP12 + - - -
-V9JP12 + ((+)) - -
-V10Jp12 + ((+)) - -
-V11JP12 + (+) - -
-V11JG1/2 + (+) - -
-V9JG1/2 + + (+) -
-V10JG1/2 + - - -
-V1JP12 + - - -
-V9JP12 + (+) - -
-V10Jp12 + - - -
-V11JP12 + (+) - -
-V1JG1/2 + - - -
-TCR γ (Einzel-PCR)
Ig κ
Sensitivität
TCR δ (Einzel-PCR)
TCR α
Genloci
Ig DHJH
Ig VHJH
TCR γ (Multiplex)
TCR δ (Multiplex)
Tabelle 12: Sensitivität der Screening-PCRs mit Agarose-Gelelektrophorese:
Legende zu Tabelle 12:
+ ≙ positiv
(+) ≙ schwach positiv ((+)) ≙ fraglich positiv
≙ BC
IV Ergebnisse
43
Rearrangement-Familie Rearranement 100 10-1 10-2 10-3 10-4
Ig κ1 + + (+) -
-Ig κ2 + + (+) -
-Ig κ3 + + (+) -
-Ig κ4 + + ((+)) -
-Ig κi + + - -
-VH1/7 + + - -
-VH2 + + - -
-VH3 + + ((+)) -
-VH4/6 + + - -
-VH5 + + - -
-VH6 + + ((+)) -
-DH1 + + (+) -
-DH2 + (+) ((+)) -
-DH3 + + (+) -
-DH4 + (+) (+) -
-DH5 + + + -
-DH6 + + (+) -
-V2Jα54 + + + +
-V2Jα29, 48 + + + +
-V2Jα9 + + + +
-V2Jα30, 55, 58, 61 + + ((+)) -
-V2D3 + ((+)) - -
-V1JD12 + (+) - -
-V3JD12 + (+) - -
-D2D3 + (+) - -
-V2JD12 + + - -
-D2JD12 + (+) - -
-V3JD12 + + - -
-V2D3 + + - -
-V1JD12 + + - -
-D2D3 + + + -
-V2JD12 + + ((+)) -
-D2JD12 + + - -
-V1JG1/2 + - - -
-V11JG1/2 + (+) - -
-V9JG1/2 + (+) - -
-V10JG1/2 + - - -
-V1JP12 + - - -
-V9JP12 + (+) - -
-V10Jp12 + - - -
-V11JP12 + (+) - -
-V11JG1/2 + + ((+)) -
-V9JG1/2 + + (+) -
-V10JG1/2 + + - -
-V1JP12 + + - -
-V9JP12 + + ((+)) -
-V10Jp12 + (+) - -
-V11JP12 + + - -
-V1JG1/2 + ((+)) - -
-Genloci Sensitivität
TCR γ (Einzel-PCR)
Ig VHJH
Ig DHJH
TCR α
TCR δ (Multiplex)
TCR δ (Einzel-PCR)
TCR γ (Multiplex)
Ig κ
Tabelle 13: Sensitivität der Screening-PCRs mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese:
Legende zu Tabelle 13:
+ ≙ positiv
(+) ≙ schwach positiv ((+)) ≙ fraglich positiv
≙ BC
IV Ergebnisse
Abbildung 5: Vergleich der Sensitivität von Agarosegel und Polyacrylamidgel.
Bande des Markers V9JP12 (TCR eindeutig positv. Aber schon die 1:10
Unterschied erkennen. Im Gegensatz dazu erscheint Polyacrylamidgel (rechts) leichter abzugrenzen 1:100-Verdünnung (10-2) erkennen.
1.3EINSATZ DES FFPEHODENMATERIAL
Da die Qualität der FFPE DNA stark variiert und es, wie oben beschrieben, bei manchen Proben inhibitorische Effekte auf die PCR
auf nachfolgende molekulargenetische Verfahren
Konsequenzen der oben beschriebenen Versuche konnte ein einheitliches Fließschema entwickelt werden, das den Einsatz des FFPE
Konzentration, Amplifizierbarkeit und Fragmentlänge festlegt und vereinheitlicht.
präsentiert das Ergebnis dieser Bestrebung. Es zeigt, dass abh DNA entweder ein (1) Standard
Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt werden kann, Genumlagerungen in testikulären Leukoblasten in einer Echt
Primern aus dem KM des Patienten besti
verwendbar ist. Entscheidungspunkte sind die spektrophometrische Konzentrationsmessung, die Amplifizierbarkeit durch Quantifizierung des
die Fragmentlängenkontrolle.
100 10-1 10-2
44
Vergleich der Sensitivität von Agarosegel und Polyacrylamidgel.
V9JP12 (TCR γ) ist nach Agarose-Gelelektrophorese eutig positv. Aber schon die 1:10-Verdünnung mit BC lässt nur noch ei
Im Gegensatz dazu erscheint die Bande der 1:10
leichter abzugrenzen. Es lässt sich sogar eine fragliche Bande der ) erkennen.
ODENMATERIALS
DNA stark variiert und es, wie oben beschrieben, bei manchen Proben ibitorische Effekte auf die PCR-Amplifizierung gibt, war es nötig, den Einfluss der Fixation auf nachfolgende molekulargenetische Verfahren zu untersuchen. Aus den Ergebnissen und Konsequenzen der oben beschriebenen Versuche konnte ein einheitliches Fließschema erden, das den Einsatz des FFPE Hodenmaterials abhängig von DNA Konzentration, Amplifizierbarkeit und Fragmentlänge festlegt und vereinheitlicht.
das Ergebnis dieser Bestrebung. Es zeigt, dass abhängig von der Qualität der FFPE Standard-Screening nach klonalen TCR/IG Genumlagerungen Gelelektrophorese durchgeführt werden kann, (2)
testikulären Leukoblasten in einer Echt-Zeit-PCR mithilfe von entworfenen des Patienten bestimmt werden können oder (3)
Entscheidungspunkte sind die spektrophometrische Konzentrationsmessung, die Amplifizierbarkeit durch Quantifizierung des β-Globin-Referenzgens mittels Echt
le.
10-3 BC MM 100 10-1
Vergleich der Sensitivität von Agarosegel und Polyacrylamidgel. Die unverdünnte lektrophorese (links) im UV-Licht sst nur noch einen schwachen die Bande der 1:10-Verdünnung auf dem . Es lässt sich sogar eine fragliche Bande der
DNA stark variiert und es, wie oben beschrieben, bei manchen Proben Amplifizierung gibt, war es nötig, den Einfluss der Fixation Aus den Ergebnissen und Konsequenzen der oben beschriebenen Versuche konnte ein einheitliches Fließschema Hodenmaterials abhängig von DNA-Konzentration, Amplifizierbarkeit und Fragmentlänge festlegt und vereinheitlicht. Abbildung 6
ängig von der Qualität der FFPE nach klonalen TCR/IG Genumlagerungen mit (2) die Identität von PCR mithilfe von entworfenen (3) die FFPE DNA nicht Entscheidungspunkte sind die spektrophometrische Konzentrationsmessung, die Referenzgens mittels Echt-Zeit-PCR und
1 10-2 BC
IV Ergebnisse
45
Abbildung 6: Fließschema zur Verwendbarkeit von FFPE DNA.
FFPE DNA Extraktion
Quantifizierung der FFPE DNA (Echt-Zeit-PCR) mithilfe dort detektierter Primer
FFPE DNA nicht verwendbar
Spezifische und sensisitve Primer verfügbar
Spektrophometrische Qualitätskontrolle
Positive Banden bis zu einer Länge von 400bp
β-Globin-Wert 10−2 (unverdünnt) oder 10-3 β-Globin-Amplifizierbarkeit
in der Echt-Zeit-PCR
Standard-Screening mit Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Verwendung der bei Rezidiv- und initialer Diagnose identifizierten
Genumlagerungsmarker β-Globin-Wert ≥10−1 oder
1:10-verdünnt ≥10-2
Keine spezifische und sensisitve Primer
verfügbar
Positive Banden bis zu einer Länge von
100bp
β-Globin-Fragmentlängen-kontrolle (PCR)
Einstellen einer Konzentration von 100ng/µl (±30ng/µl) möglich
Konzentration nicht messbar
β-Globin-Wert <10−3
46 IV Ergebnisse
2 Beschreibung des Patientenkollektives
Das Alter der 35 Jungen betrug bei Diagnose der Ersterkrankung im Median 4,5 Jahre (0-16 Jahre). Der Altersmedian zum Zeitpunkt des Hodenrezidivs lag bei 8,3 Jahren (1-19 Jahre).
Tabelle 14: Klinische Parameter des Patientenkollektivs
Parameter Kategorie n
Alter bei Erstdiagnose <5 Jahre 19-54%
5 - 10 Jahre 3-9%
≥10 Jahre 13-37%
Alter Rezidivdiagnose <5 Jahre 5-14%
5 - 10 Jahre 14-40%
≥10 Jahre 16-46%
Zeitpunkt sehr früh 3-9%
früh 14-40%
spät 18-51%
Immunphänotyp 0-ALL 1-3%
c-ALL 22-69%
prä-T-ALL 2-6%
prä-B-ALL 6-19%
kortik. T-ALL 1-3%
keine Angabe 3-/
TEL/AML-1 negativ 19-61%
Transfusionsgen positiv 12-39%
(nur BCP-ALL) keine Angabe 1-/
periphere Blastenzahl 0-100/µl 20-61%
>100/µl 13-39%
keine Angabe 2-/
Protokoll ALL-REZ BFM 96 9-26,5%
ALL-REZ BFM 02 25-73,5%
keine Angabe 2-/
Klonalität monoklonal 24-68,5%
oligoklonal 10-28,5%
polyklonal 1-3%
Der Rezidivzeitpunkt war überwiegend spät: Vier Jungen (11,1%) erkrankten an einem sehr frühen, 43 (38,9%) an einem frühen und 18 Jungen (50,0%) an einem späten kombinierten Hodenrezidiv. Die Dauer zwischen initialer Diagnose und Rezidivdiagnose betrug im Median
IV Ergebnisse
47
2,5 Jahre (25. Perzentile: 2,3 Jahre, 75. Perzentile: 3,5 Jahre). Bei vier Jungen (11,1%) wurde eine ZNS-Beteiligung bei Diagnose des kombinierten Hodenrezidivs festgestellt. Der Großteil der Patienten (n=30, 83,3%) wurde in die Strategiegruppe 2 eingeteilt. Die drei Jungen mit sehr frühem Rezidiv (#3, #26, #27) sowie zwei weitere Patienten mit T-ALL (#5, #11) wurden in die Hochrisikogruppe S4 stratifiziert. Weitere klinische Daten fasst Tabelle 14 zusammen.
3 Häufigkeit der Genumlagerungen
318 klonale Genumlagerungen wurden im PCR-Screening in 94 Patientenproben identifiziert.
Das Kreisdiagramm in Abbildung 7 zeigt die Häufigkeitsverteilung der sieben Rearrangement-Familien. Durchschnittlich konnten pro Patient 4,4 Marker detektiert werden. In der einzelnen DNA-Probe konnten insgesamt 3,6 (0-8) Genumlagerungsmarker im Durchschnitt gefunden werden. Die Analysen der KM-Proben der Initialdiagnose und des kombinierten Rezidivs brachten beide 3,5 Marker (1-7 beziehungsweise 0-7) und der aus dem Hoden isolierten Blasten durchschnittlich 3,7 (0-8) Marker hervor. Wertet man die auf MRD-Niveau unter 10-2 gemessenen subklonalen IG- und TCR-Genumlagerungen als negativ, wurden in den Proben der Initialdiagnose durchschnittlich 3,3 (1-7), im KM des kombinierten Rezidivs 3,3 (0-7) und im Hoden 3,7 (0-7) Marker identifiziert. Während bei den Ersterkrankungen von 65 identifizierten Markern fünf subklonal gemessen werden konnten (8%) und im KM des Rezidivs von 124 zehn subklonale Genumlagerungen vorlagen (8%), waren es im Hoden zwei bei insgesamt 129 Markern (1,5%). Eine mediane Markerzahl von 3,0 wurde in den Proben der Initialdiagnosen gefunden unter der Annahme, dass nur die hauptklonalen Marker zählen. Dahingegen waren es im Median 3,5 Marker für den Fall, dass subklonale Marker miteingefasst wurden. In den Proben des kombinierten Rezidivs betrug die mediane Anzahl der IG- und TCR-Genumlagerungen hauptklonal und subklonal jeweils 3,0 Marker. Abbildung 8 bringt überblicksartig die Anzahl der Proben mit der jeweiligen Markeranzahl in Verbindung. Die Auswertung wurde an dieser Stelle nach Erkrankungsstadium und Entnahmeort differenziert. In DNA-Proben der Initialdiagnose wurden in allen Fällen mindestens ein und in 89% mindestens zwei Marker gefunden. Die KM-Analyse des kombinierten Rezidivs fiel mit 92% beziehungsweise 83% niedriger aus. In den Hodenproben, die die oben genannten Qualitätskriterien erfüllten, wurden im PCR-Screening in 97% mindestens ein und in 86% mindestens zwei klonale Genumlagerungen detektiert. Die Balkendiagramme in Abbildung 9 bis 11 beziehen sich mit ihrer Auswertung der Frequenz der Genumlagerungen ausschließlich auf BCP-ALL-Patienten. Sie zeigen, dass am häufigsten mindestens eine Genumlagerung aus der IG VHJH- und TCR γ-Familie identifiziert werden
IV Ergebnisse
48 Ig VHJH
25%
Ig DHJH 8%
Ig κ 17%
TCR γ 22%
TCR δ 15%
TCR α 8%
TCR β 5%
konnte. Dagegen finden sich in 100% der vier T-ALL-Patientenproben mit T-ALL mindestens ein Marker der TCR β- und TCR γ-Familie.
Abbildung 7: Inzidenz aller identifizierten IG- und TCR-Genumlagerungen. Die 318 im PCR-Screening identifizierten Marker verteilen sich zu 50% auf IG- und zu 50% auf TCR-Genumlagerungen.
Abbildung 8: Anzahl identifizierter Genumlagerungen pro analysierter DNA-Probe.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Anzahl der DNA-Proben
Anzahl der im Screening identifizierten Genumlagerungen
Initialdiagnose KM komb. Rezidiv Hoden
0 1 2 3 4 5 6 7 8
IV Ergebnisse
49
Abbildung 9: Diese Auswertung bezieht sich auf BCP-ALL Proben der Initialdiagnose (n=15).
Das Diagramm zeigt den Anteil der Proben, in denen mindestens eine entsprechende Genumlagerung identifiziert werden konnte.
Abbildung 10: Diese Auswertung bezieht sich auf BCP-ALL Proben des KMs des kombinierten Rezidivs (n=32). Das Diagramm zeigt den Anteil der Proben, in denen mindestens eine entsprechende Genumlagerung identifiziert werden konnte.
0%
44%
44%
50%
50%
25%
69%
keiner TCR d TCR a Ig k TCR g DHJH VHJH
Anteil der DNA-Proben mit mindestens einer der aufgeführten Genumlagerungen IG VHJH
IG DHJH
TCRγ
IGκ
TCRα
TCR δ
keine
8%
34%
56%
69%
19%
56%
keiner TCR d TCR a Ig k TCR g DHJH VHJH
Anteil der DNA-Proben mit mindestens einer der aufgeführten Genumlagerungen IG VHJH
IG DHJH
TCRγ
IGκ
TCRα
TCR δ
keine
41%
IV Ergebnisse
50
Abbildung 11: Diese Auswertung bezieht sich auf BCP-ALL Proben des Hodens (n=29). Das Diagramm zeigt den Anteil der Proben, in denen mindestens eine entsprechende Genumlagerung identifiziert werden konnte.
3%
41%
59%
73%
73%
23%
82%
keiner TCR d TCR a Ig k TCR g DHJH VHJH
Anteil der DNA-Proben mit mindestens einer der aufgeführten Genumlagerungen IG VHJH
IG DHJH
TCRγ
IGκ
TCRα
TCR δ
keine
51 IV Ergebnisse
4 Ergebnisse des PCR-Screenings und der Echt-Zeit-Quantifizierung
Im Folgenden werden die Ergebnisse der einzelnen Fälle vorgestellt. Die Übersichten „Patient
#1“ bis „Patient #35“ präsentieren die klonalen IG- und TCR-Genumlagerungsmuster, die sich aus der molekulargenetischen Untersuchung des KMs der Initialdiagnose, des KMs des ersten oder zweiten kombinierten Hodenrezidivs sowie weiterer KM-Proben ergeben. In einigen Fällen weist die Abkürzung „n.a.“ (nicht analysierbar) darauf hin, dass keine ausreichend spezifischen beziehungsweise sensitiven Primer entworfen werden konnten, um das negative Screening-Ergebnis zu quantifizieren. War eine Genumlagerung nicht messbar, wurde der Bereich unter der Sensitivitätsgrenze als wahre Aussage mitaufgenommen. Ein „+“ steht für ein positives, ein „-“
für ein negatives Screening-Ergebnis. In den Fällen, in denen die FFPE DNA in der β-Globin Referenzgenbestimmung 1:10 verdünnt einen Wert von beispielsweise 10-2 und 1:100 verdünnt einen Wert von 10-3 hatte und ein Genumlagerungsmarker in der quantitativen Echt-Zeit-PCR - es wurde bei vorhandener Inhibition die 1:10 Verdünnung eingesetzt - dann bei 10-3 gemessen wurde, ist in den folgenden Übersichten der geschlossene Wert 10-1 zu finden.
52 IV Ergebnisse
Patient #1: TEL/AML-1 positive c-ALL und spätes Rezidiv. 25% Blastenanteil im KM des 1. Rezidivs.
#1 VH3DH6JH4 VκII-κde VκIV-κde Vg1Jg1/2 Vg9Jg1/2 V2D3Jα58 V2D3Jα29 V2D3
Initialdiagnose KM + + + + + + <10-2 +
1. Rezidiv KM + + + + + 10-2 + +
Hoden, frisch + + + + + + 10-1 +
Patient #2: Prä-B-ALL, frühes Rezidiv und ZNS-Beteiligung. 96% Blastenanteil im KM des 1. Rezidivs.
#2 VκII-κde Vg1Jp1/2 Vg1Jg1/2 V2D3Jα54
Initialdiagnose KM + + 10-4 +
1. Rezidiv KM + + + +
Hoden, frisch + + + +
Patient #3: Prä-B-ALL und sehr frühes Rezidiv. 37% Blastenanteil im KM des 2. Rezidivs.
#3 VH3DH6JH3 VH3DH2JH4 Vκi-κde V2D3 V2D3Jα58 V2D3Jα48 V2Jα29
Initialdiagnose KM + + n.a. + <10-4 <10-3 +
1. Rezidiv KM + + n.a. + + 10-2 n.a.
2. Rezidiv KM + + n.a. + + 10-2 n.a.
Hoden, frisch + + + + + + n.a.
IV Ergebnisse
53
Patient #4: c-ALL und frühes Rezidiv. Es waren nur die initialen Marker, kein KM-Material verfügbar. 6% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#4 VH1DH3JH4 VH2DH5JH4 Vg1Jg1/2 (1) Vg1Jg1/2 (2) V2Jα29
Initialdiagnose KM + + - - -
1. Rezidiv KM <10-3 <10-4 n.a. <10-3 <10-3
Hoden, frisch + + + + +
2. Rezidiv KM + + + + +
Patient #5: Kortikale T-ALL und frühes Rezidiv. Nur initiale Marker, kein KM-Material verfügbar. 34% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#5 Vg1Jg1/2 Vβ5Jβ1.1 Dβ2Jβ2.2
Initialdiagnose KM - + +
1. Rezidiv KM 10-1 + +
Hoden, frisch + + +
Patient #6: TEL/AML-1 positive c-ALL und spätes Rezidiv. 94% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#6 VH6DH2JH6 Vg9Jg1/2 Vg1Jg1/2 V2D3 V2D3Jα29
Initialdiagnose KM + <10-3 + + +
1. Rezidiv KM + <10-3 + + +
Hoden, frisch + + + + +
IV Ergebnisse
54
Patient #7: TEL/AML-1 positive c-ALL und spätes Rezidiv. KM-Material der Initialdiagnose wurde aufgebraucht. 91% Blasten im KM des 1.
Rezidivs.
#7 VH3DH6JH6 VH4DH7JH6 VH4JH5 VκII-κde Vg9Jg1/2 Vg1Jg1/2 V2D3 V2D3Jα30
Initialdiagnose KM 10-4 + + 10-4 10-5 + + 10-4
1. Rezidiv KM + - - + + - - +
Hoden, frisch + - - + 10-4 - - +
Patient #8: TEL/AML-1 positiver c-ALL und spätem Rezidiv. 94% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#8 Vκi-κde Vg1Jg1/2 V2D3Jα29
Initialdiagnose KM + + +
1. Rezidiv KM + + +
Hoden, frisch + + +
Patient #9: c-ALL und spätes Rezidiv. 59% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#9 DH3JH4 DH5JH4
Initialdiagnose KM polyklonal 1
1. Rezidiv KM polyklonal n.a.
Hoden, frisch polyklonal n.a.
IV Ergebnisse
55
Patient #10: c-ALL und frühes Rezidiv mit ZNS-Beteiligung. FFPE DNA war für das PCR-Screening geeignet. 15% Blasten im KM des 1.
Rezidivs.
#10 VH4JH4 VH2JH6 Vκi-κde V2D3 (1) V2D3 (2) Dβ2Jβ2.7
Initialdiagnose KM + + + + + +
1. Rezidiv KM 10-3 10-3 + <10-3 <10-3 <10-4
Hoden, FFPE + + n.a + + +
Patient #11: Prä-T-ALL und frühes Rezidiv. FFPE DNA war für das PCR-Screening geeignet. 98% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#11 Vg1Jg1/2 Vβ2Dβ1.2 Vβ10Jβ1.2 Dβ2Jβ2.7
Initialdiagnose KM + + + +
1. Rezidiv KM + + + +
Hoden, FFPE + + + +
Patient #12: TEL/AML-1 positive 0-ALL und spätes Rezidiv. FFPE DNA war für das PCR-Screening geeignet. 88% Blasten im KM des 1.
Rezidivs.
#12 VHDH2JH6 V2D3Jα29
Initialdiagnose KM + <10-4
1. Rezidiv KM + +
Hoden, FFPE + +
IV Ergebnisse
56
Patient #13: c-ALL und spätes Rezidiv mit ZNS-Beteiligung. FFPE DNA war für die Quantifizierung geeignet. 79% Blasten im KM des 1.
Rezidivs.
#13 DH2JH5 V2D3 (1) V2D3 (2) Vd2Jd1/2
Initialdiagnose KM + + + +
1. Rezidiv KM + + + +
Hoden, FFPE 100 n.a. n.a. n.a.
Patient #14: c-ALL und spätes Rezidiv. FFPE DNA war für die Quantifizierung geeignet. 95% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#14 VκII-κde Vκi-κde Vg2Jg1/2
Initialdiagnose KM + + +
1. Rezidiv KM + + +
Hoden, FFPE 100 100 100
Patient #15: c-ALL und spätes Rezidiv. FFPE DNA war für das PCR-Screening geeignet. Es waren nur die initialen Marker, dahingegen kein KM-Material verfügbar. 95% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#15 VH3DH4JH4 VH4DH2JH5 VκIII-κde Vg9Jg1/2 Vg9Jp1/2 V2D3
Initialdiagnose KM + + + + + +
1. Rezidiv KM <10-4 <10-3 <10-4 n.a. n.a. n.a.
Hoden, FFPE + + + n.a. n.a. n.a.
IV Ergebnisse
57
Patient #16: TEL/AML-1 positive prä-B-ALL und spätes Rezidiv. FFPE DNA war für die Quantifizierung geeignet. 95% Blasten im KM des 1.
Rezidivs.
#16 VκI-κde Vg1Jg1/2 V2Jα29
Initialdiagnose KM + n.a. +
1. Rezidiv KM + + +
Hoden, FFPE >100 n.a. 10-1
Patient #17: c-ALL und spätes Rezidiv. FFPE DNA war für die Quantifizierung geeignet. Es waren nur die initialen Marker, dahingegen kein KM-Material verfügbar. 95% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#17 VH3DH6JH1 DH7JH4 DH3JH5
Initialdiagnose KM + + -
1. Rezidiv KM + + +
Hoden, FFPE 100 n.a. 100
Patient #18: TEL/AML-1 positive BPC-ALL und spätes Rezidiv. 57% Blasten im KM des 1. Rezidivs.
#18 Vg1Jg1/2 Vg1Jp1/2 V2D3Jα29
1. Rezidiv KM + + +
Hoden, frisch + + +