C. Ergebnisse
4. Ergebnisse der Durchflusszytometrie
Ergebnisse
Abbildung 6. Caspase-1 im Serum. Kastendiagramm mit logarithmischer Skala. Median mit Interquartilsabstand, die Antennen zeigen die 5. und 95. Perzentile.
Anzahl Median Spannweite
Patienten Homozygote 5
336 380
107-1552 265-1552
Kombiniert Heterozygote 6 204 107-424
Heterozygot Gesunde 6 263 140-275
Kontrollen 7 197 68-254
Tabelle 16. Caspase-1 im Serum, Median und Spannweite in pg/ml.
Ergebnisse
Abbildung 7. Exemplarischer Ablauf beim Auswerten der Messergebnisse der Durchflusszytometrie.
1. Gaten in zwei Schritten: a) Im ersten Schritt wurden Seitwärtsstreulicht und CD45-bindende Zellen zueinander dargestellt. Die drei Anhäufungen von Ereignissen mit jeweils gleichen Eigenschaften waren Leukozyten (A), Lymphozyten (B) und Zelltrümmer (evtl. mit einigen Erythrozyten) (C). b) Im zweiten Gating-Schritt wurden die als Leukozyten identifizierten Zellen hinsichtlich ihrer Expression von CD16 und CD45 dargestellt. So konnten die neutrophilen Granulozyten (D), von den eosinophilen Granulozyten (E) unterschieden werden. Die Population der Granulozyten wurde dann auf die Expression von CD11b und CD62L untersucht.
2. Isotypen-Messung: Messung von unspezifischer Fluoreszenz durch Färbung von IgG1 der Maus, gekoppelt an FITC (für CD62L) und APC (für CD11b). Festgelegt wurde, dass in dieser Messung 1% der Ereignisse als tatsächlich positiv gewertet werden konnte. An dieser Stelle wurde im Histogramm eine Markierung gespeichert, welche dann auf die Messungen von CD62L und CD11b übernommen wurde. FI – Fluoreszenz-Intensität.
3. Kinetik-Ansätze: Die Markierung der Grenze für als positiv zu wertende Ereignisse wurde für alle Kinetik-Ansätze übernommen. Nur die rechts der Markierung detektierten Ereignisse wurden als positiv gewertet und in die Berechnung mit einbezogen.
4. Stimulationsansätze: Für jeden Stimulationsansatz wurde eine eigene Isotypen-Messung mit Setzung einer entsprechenden Markierung durchgeführt (in der Abbildung nicht gezeigt).
C. 4.a. CD62L im Zeitverlauf
Bei der Durchflusszytometrie zeigt eine Abnahme des CD62L-Signals auf den neutrophilen Granulozyten – im Vergleich zu einer vorherigen Messung desselben Materials – eine Aktivierung der Granulozyten in dieser Zeit oder durch die stattgefundene Stimulation an, da das Protein von der Zelloberfläche abgespalten worden sein muss.[110]
Bei der Messung des Oberflächenmarkers CD62L auf den Granulozyten zeigte sich ein deutlicher Unterschied zwischen den Gruppen, vor allem in der Kinetik des Markers. Während der fünf Stunden Inkubation fiel der Wert bei den Patienten deutlich ab, bis auf 26,6 % des Ausgangswertes. Bei den heterozygot Gesunden wurde nur ein Teil des L-Selektin abgespalten (66,8% des Ausgangswertes) und bei den Kontrollen blieb die Fluoreszenzintensität fast so hoch wie zu Beginn der Stimulation (86,2 %). Der Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und den beiden anderen Gruppen zeigte sich ab Stunde 2 signifikant (p=0,001 bei Vergleich der Patienten mit den Kontrollen; p=0,0411 bei Vergleich der Kontrollen mit den heterozygot Gesunden). Ab Stunde 3 waren die Unterschiede zwischen allen Gruppen signifikant bis hoch signifikant. Ab Stunde 5 jedoch beginnt auch bei den Kontrollen eine Abspaltung des CD62L von den Neutrophilen, sodass dann der Unterschied zwischen den gesunden Heterozygoten und den gesunden Kontrollen nicht mehr statistisch signifikant ist (66,8% zu 86,2% verbleibender Oberflächenproteine im Median, p=0649).
Eine genaue Auflistung der errechneten Verhältnisse und der Signifikanzen zeigt Tabelle 17.
Abbildung 8. Zeitverlauf von CD62L. Abgetragen sind Median und Interquartilsabstand. Werte in Prozent.
Beginn1/2 h 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
Zeit
% der anfänglichen gMFI
Patienten (n=10)
Heterozygot Gesunde (n=6) Kontrollen (n=6)
Ergebnisse
versus
Ratio, prozentual zu „unstimuliert vor Stimulation“, Median (Spannweite)
p-Wert Signifikanz- niveau 1 Stunde
Patienten Kontrollen 93,2 (50-115,5) 106 (92,9-120,6) 0,0293 * 2 Stunden
Patienten Het. Gesunde
47,7 (18,8-77.3) 75,2 (56,3-108,5) 0,011 *
Kontrollen 103,2 (88,9-112,2) 0,0002 ***
Het. Gesunde Kontrollen 75,2 (56,3-108,5) 103,2 (88,9-112,2) 0,026 * 3 Stunden
Patienten Het. Gesunde
43,1 (16,6-60,8) 74,1 (50,9-122,3) 0,003 **
Kontrollen 103,6 (83,7-124,1) 0,0002 ***
4 Stunden
Patienten Het. Gesunde 31,1 (12,8-63,2) 62,6 (45,5-79,7) 0,016 * Kontrollen Patienten
96,7 (82,5-119,6) 31,1 (12,8-63,2) 0,0002 ***
Het. Gesunde 62,6 (45,5-79,7) 0,0022 **
5 Stunden
Patienten Het. Gesunde
26,6 (14,3-65,4) 66,8 (45,7-94,6) 0,0028 **
Kontrollen 86,2 (73,9-112,6) 0,0004 ***
Tabelle 17. Zeitverlauf von CD62L. Median und Spannweite in Prozent sowie Signifikanzniveau der Vergleiche zwischen den Gruppen (ausgenommen nicht signifikante Vergleiche).
C. 4.b. Stimulation
C. 4.b.i. CD62L
Bei der Messung des L-Selektin auf der Oberfläche der Neutrophilen nach deren Stimulation zeigten sich vor allem signifikante Unterschiede innerhalb der Gruppen, also zwischen den verschiedenen Stimulationsansätzen.
In der Kontrollgruppe ist gut erkennbar, dass eine Stimulation der Zellen mit LPS und ATP zu einer beinahe kompletten Abspaltung des CD62L von der Zelloberfläche und somit zu einer Aktivierung der Granulozyten führt. Die mit LPS und ATP stimulierten Zellen senken den Anteil von CD62L auf 32,3 % im Median, bei Zugabe von Colchizin, LPS und ATP verbleiben 28,6 %.
Setzt man den Neutrophilen ausschließlich Colchizin zu, scheint auch eine Aktivierung zu geschehen, allerdings werden nur etwa ein Drittel der Proteinmoleküle abgespalten (67,4 % verbleibend).
Diesem allgemeinen Muster folgen auch die Proben der anderen beiden Gruppen. Der Unterschied liegt hier allerdings darin, dass vor allem bei den FMF-Patienten bereits unstimuliert schon ein großer Teil des L-Selektin abgespalten wurde. Somit sinkt der Anteil in den anderen Stimulationsansätzen im Vergleich zum unstimulierten, aber inkubierten Ansatz nicht.
So ergibt sich, dass bei den Kontrollen auch im Ansatz „unstimuliert nach Stimulation“ noch signifikant mehr CD62L gemessen wird, als in den drei mit Stimulantien versetzten Proben (jeweils p=0,0156).
Bei den gesund heterozygoten Probanden konnten im Vergleich zum Ansatz „unstimuliert nach Stimulation“ nur durch die Stimulation mit LPS + ATP und auch Colchizin + LPS + ATP signifikant mehr aktivierte Granulozyten (also weniger CD62L) gemessen werden (p=0,0312), nicht jedoch in dem Ansatz mit Colchizin allein.
Die Gruppe der FMF-Patienten weist im Ansatz mit Colchizin den höchsten Anteil an CD62L auf den Granulozyten auf, hier sind im Vergleich zum Ansatz vor der Stimulation noch 54,5 % CD62L gebunden. Ohne Colchizin beträgt der Anteil nur 31,4 %. Durch Zugabe von LPS + ATP, aber auch LPS + ATP + Colchizin werden die Granulozyten maximal aktiviert und es verbleiben nur 27 % beziehungsweise 16,9 % des Oberflächenmarkers auf den Zellen. Insgesamt spalten die Granulozyten der Patienten jedoch in jedem Stimulationsansatz im Vergleich zum unstimulierten Ansatz vor der Inkubation in signifikantem Ausmaß CD62L ab (mit p=0,002 für alle Ansätze).
Über alle signifikanten Unterschiede innerhalb der Probandengruppen gibt Tabelle 18 Aufschluss.
Abbildung 9. CD62L in den Stimulationsansätzen. Kastendiagramm. Median mit Interquartilsabstand, die Antennen zeigen die 5. und 95. Perzentile. Werte in Prozent.
versus
Ratio, prozentual zu „unstimuliert vor Stimulation“, Median (Spannweite)
p-Wert Signifikanz- niveau Patienten
vor Stimulation
unst. nach Stim.
100
31,4 (23,7-67,4) 0,002 **
LPS + ATP 27,0 (8,2-42,3) 0,002 **
Colchizin 54,5 (33,4-79,4) 0,002 **
Col + LPS + ATP 16,9 (9,8-45,0) 0,002 **
unst. nach Stim. Col + LPS + ATP 31,4 (23,7-67,4) 16,9 (9,8-45,0) 0,002 **
Colchizin LPS + ATP
54,5 (33,4-79,4) 27,0 (8,2-42,3) 0,0039 **
Col + LPS + ATP 16,9 (9,8-45,0) 0,002 **
unstimuliert nach Stimulation
LPS + ATP Colchizin Colchizin + LPS + ATP 0
20 40 60 80 100 120 140
% der anfänglichen gMFI
Patienten (n=10)
Heterozygot Gesunde (n=6) Kontrollen (n=7)
Ergebnisse
Heterozygot Gesunde vor Stimulation
unst. nach Stim.
100
66,8 (45,7-94,6) 0,0312 *
Colchizin 49,9 (37,0-56,8) 0,0312 *
Col + LPS + ATP 16,9 (14,4-40,0) 0,0312 *
unst. nach Stim. Colchizin
66,8 (45,7-94,6) 49,9 (37,0-56,8) 0,0312 *
Col + LPS + ATP 16,9 (14,4-40,0) 0,0312 *
Colchizin + LPS + ATP
LPS + ATP
16,9 (14,4-40,0) 24,2 (16,6-122,0) 0,0312 *
Colchizin 49,9 (37,0-56,8) 0,0312 *
Kontrollen vor Stimulation
LPS + ATP
100
32,3 (14,7-43,2) 0,0156 *
Colchizin 67,4 (43,8-81,5) 0,0156 *
Col + LPS + ATP 28,6 (21,2-40,3) 0,0156 *
unst. nach Stim.
LPS + ATP
91,5 (73,9-125,0)
32,3 (14,7-43,2) 0,0156 *
Colchizin 67,4 (43,8-81,5) 0,0156 *
Col + LPS + ATP 28,6 (21,2-40,3) 0,0156 *
Colchizin LPS + ATP
67,4 (43,8-81,5) 32,3 (14,7-43,2) 0,0156 *
Col + LPS + ATP 28,6 (21,2-40,3) 0,0156 *
unstimuliert nach Stimulation Patienten Het. Gesunde
31,4 (23,7-67,4) 66,8 (45,7-94,6) 0,011 *
Kontrollen 91,5 (73,9-125,0) 0,0001 ***
Kontrollen Het. Gesunde 91,5 (73,9-125,0) 66,8 (45,7-94,6) 0,0221 *
Tabelle 18. CD62L in den Stimulationsansätzen. Median und Spannweite in Prozent sowie Signifikanzniveau der Vergleiche zwischen den Gruppen und zwischen den Ansätzen in den Gruppen (ausgenommen nicht signifikante Vergleiche).
C. 4.b.ii. CD11b
Der Zusammenhang zwischen Aktivierung der neutrophilen Granulozyten und signifikanter Erhöhung des Signals von CD11b im Durchflusszytometer zeigte sich auch hier. Dabei scheint es sich allerdings um eine Genotyp-unabhängige Reaktion zu handeln. Bei allen drei Probandengruppen lässt sich so nachweisen, dass die Zellen durch LPS+ATP zu einer entzündlichen Reaktion stimuliert werden. Auch zusätzliches Colchizin kann diese Erhöhung von CD11b auf der Zelloberfläche nicht vermindern. Im Gegensatz dazu löst Colchizin allein bei allen Gruppen keine solche Aktivierung aus.
In der Kontrollgruppe kommt es zu einem – im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen signifikanten – Abfall von CD11b innerhalb der Inkubationszeit. Während der prozentuale Abfall (nach Inkubation/vor Inkubation) bei beiden Gruppen mit MEFV-Mutation nur jeweils 10,8 % beträgt, liegt er bei den Kontrollen mit 38,1 % signifikant darüber (p=0,0012).
Abbildung 10. CD11b in den Stimulationsansätzen. Kastendiagramm. Median mit Interquartilsabstand, die Antennen zeigen die 5. und 95. Perzentile. Werte in Prozent.
versus
Ratio, prozentual zu „unstimuliert vor Stimulation“, Median (Spannweite)
p-Wert
Signifikanz- niveau Patienten
vor Stimulation
LPS + ATP
100
212,8 (130,5-332,3) 0,002 **
Colchizin 91,0 (62,6-122,3) 0,0371 *
Col + LPS + ATP 261,0 (116,8-338,2) 0,002 **
unst. nach Stim. LPS + ATP
89,2 (67,8-125,6) 212,8 (130,5-332,3) 0,002 **
Col + LPS + ATP 261,0 (116,8-338,2) 0,002 **
Colchizin LPS + ATP
91,0 (62,6-122,3) 212,8 (130,5-332,3) 0,002 **
Col + LPS + ATP 261,0 (116,8-338,2) 0,002 **
Heterozygot Gesunde
vor Stimulation LPS + ATP
100 249,9 (111,0-444,5) 0,0312 * Col + LPS + ATP 233,4 (112,4-432,8) 0,0312 * unst. nach Stim. LPS + ATP
89,2 (78,1-104,3) 249,9 (111,0-444,5) 0,0312 * Col + LPS + ATP 233,4 (112,4-432,8) 0,0312 * Colchizin LPS + ATP
96,5 (79,2-103,6) 249,9 (111,0-444,5) 0,0312 * Col + LPS + ATP 233,4 (112,4-432,8) 0,0312 * Kontrollen
vor Stimulation
unstim. nach St.
100
61,9 (52,4-72,0) 0,0156 *
LPS + ATP 201,5 (119,3-257,8) 0,0156 *
Colchizin 76,3 (39,2-99,8) 0,0156 *
Col + LPS + ATP 205,9 (94,1-256,1) 0,0312 *
unst. nach Stim. LPS + ATP
61,9 (52,4-72,0) 201,5 (119,3-257,8) 0,0156 *
Col + LPS + ATP 205,9 (94,1-256,1) 0,0156 *
Colchizin LPS + ATP
76,3 (39,2-99,8) 201,5 (119,3-257,8) 0,0156 *
Col + LPS + ATP 205,9 (94,1-256,1) 0,0156 *
unstimuliert nach Stimulation
LPS + ATP Colchizin Colchizin + LPS + ATP 0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
% der anfänglichen gMFI
Patienten (n=10)
Heterozygot Gesunde (n=6) Kontrollen (n=7)
Ergebnisse
unstimuliert nach Stimulation Kontrollen Patienten
61,9 (52,4-72,0) 89,2 (67,8-125,6) 0,0012 **
Het. Gesunde 89,2 (78,1-104,3) 0,0012 **
Tabelle 19. CD11b in den Stimulationsansätzen. Median und Spannweite in Prozent sowie Signifikanzniveau der Vergleiche zwischen den Gruppen und zwischen den Ansätzen in den Gruppen (ausgenommen nicht signifikante Vergleiche).