0 0,5 1 1,5 2 2,5
0 wk 1 wk 12 wk
EF50 (ml/s)
0 25 50 75 100 125
PBS OVA wk 1 OVA wk 12 MCh50 (mg/ml)
* ** ***
Abb. 3.7.1 Einfluss chronischer Allergenprovokation auf die Lungenfunktion: A) Atemwegsreabilität gegenüber β-Methyl-Acetylcholin; B) Atemphysiologie
BALB/c Mäuse (je Gruppe n=8) wurden wie in Material und Methoden beschrieben mit OVA sensibilisiert und provoziert (siehe Abb. 2.2.3). Die Atemwegsreabilität (AR) bzw. der expiratorische Atemfluss (EF50) wurde 24 Stunden nach der zweiten (OVA wk 1) bzw. nach der letzten OVA-Exposition (OVA wk 12) mittels Head-out Body-Plethysmographie bestimmt. Die AR wird als die Konzentration an β-Methyl-Acetylcholin (MCh50) ausgedrückt, die eine 50%ige Reduktion des Ausgangswerts des halbmaximalen expiratorischen Atemflusses bewirkt.
Dargestellt sind Mittelwerte ± S.E.M. (* p < 0,05).
Der EF50 der PBS- bzw. OVA-Tiere vor Beginn der Experimentalserie lag zwischen 1,71 ml/s und 1,75 ml/s. Während sich der EF50 der PBS-Gruppe im Verlauf des Experiments auf 1,89 ± 0,07 ml/s erhöhte, stellte sich in der OVA-Gruppe nach chronischer Allergenexposition eine deutliche Verringerung des EF50 ein. Mit 1,34 ± 0,09 ml/s war dieser sowohl im Vergleich zum Ausgangswert der OVA-Gruppe, wie auch zum EF50 der gleichaltrigen PBS-Gruppe, signifikant verringert, was auf einen erhöhten Atemwegswiderstand hindeuten könnte.
3.8 Eosinophile Granulozyten spielen eine zentrale Rolle innerhalb des
einer Atemwegshyperreagibilität eine entscheidende Rolle zu spielen. Um diese Hypothese zu untersuchen wurde in dem in dieser Arbeit etablierten Mausmodell für ein chronisch-allergisches Asthma ein CCR-3-Antagonist eingesetzt, der effizient die Infiltration eosinophiler Granulozyten aus dem Gefäßsystem in das Zielgewebe, in diesem Fall in das Atemwegsgewebe, verhindert.
Tabelle 3.8.1: Die anti-inflammatorischen Effekte des CCR-3-Antagonisten auf die akute allergische Atemwegsentzündung
PBS OVA CCR-3 Ant.
10 mg/kg KG
CCR-3 Ant.
30 mg/kg KG Zellen in der
BAL (104/BAL):1) eosinophile G.
Lymphozyten Makrophagen
0,01 ± 0,01 0,08 ± 0,04 4,89 ± 1,08
148,06 ± 8,20 14,33 ± 1,85 19,77 ± 1,63
94,83 ± 6,63 22,99 ± 2,47**
20,89 ± 1,81
85,10 ± 9,10 15,13 ± 7,85**
18,67 ± 1,90
Zytokine in der BAL (pg/ml):2)
IL-4 IL-5 IFN-γ TNF-α
unter DL unter DL 25,8 ± 2,9
unter DL
41,2 ± 5,9 140,1 ± 14,9
27,7 ± 5,5 63,5 ± 15,7
37,8 ± 7,1 133,7 ± 18,6
22,8 ± 4,0 55,7 ± 13,4
35,0 ± 5,5 119,5 ± 17,0
30,2 ± 6,2 51,6 ± 9,1
MCh50
(mg/ml)3)
88,9 ± 7,8 54,4 ± 2,8 59,5 ± 6,6 78,4 ± 2,5**
BALB/c Mäuse (je Gruppe n=8) wurden wie in Material und Methoden beschrieben mit OVA sensibilisiert und provoziert (siehe Abb. 2.2.1). Der CCR-3-Antagonist wurde in zwei verschiedenen Dosen je 30 Minuten vor und 5 Stunden nach der OVA-Challenge per os appliziert.
Alle Analysen fanden ca. 24 Stunden nach der letzten OVA-Challenge statt. 1)Absolute Anzahl an Leukozyten in der BAL. Zytokin-Konzentration in der BAL-Flüssigkeit bestimmt durch CBA-Technik.3)Die Atemwegsreabilität wurde mittels Head-out Body-Plethysmographie bestimmt und wird als die Konzentration an β-Methyl-Acetylcholin (MCh50) ausgedrückt, die eine 50%ige Reduktion des Ausgangswerts des halbmaximalen expiratorischen Atemflusses bewirkt.
Dargestellt sind Mittelwerte ± S.E.M. (* p < 0,05; **p < 0,01).
Die Wirkung dieses CCR-3-Antagonisten auf die allergische Atemwegsentzündung wurde zunächst in einem weniger aufwendigen Modell des akuten allergischen Asthmas untersucht. Dabei wurden zwei verschiedene Konzentrationen verwendetet, 10 bzw. 30 mg/kg Körpergewicht (KG) der Maus.
Untersucht wurde das Ausmaß der leukozytäre Infiltration in das broncho-alveoläre Lumen, die Level der Zytokine IL-4, IL-5, IFN-γ und TNF-α in der BAL und die Atemwegsreagibilität. Dabei zeigte sich, dass die Dosis von 10 mg/kg KG zwar die Anzahl eosinophiler Granulozyten in der BAL um ca. 30% verringerte, allerdings, zu keiner wesentlichen Veränderung der Atemwegsreagibilität führte.
Die Dosis von 30 mg/kg KG reduzierte die Anzahl der eosinophilen Granulozyten in der BAL um ca. 40%, wobei die Menge an infiltrierten Lymphozyten oder Makrophagen im Vergleich zur OVA-Gruppe, die als positive Kontrollgruppe diente, nicht verändert waren. Auch die gemessenen Zytokinspiegel waren im Vergleich zur OVA-Gruppe unverändert hoch. Die Verringerung der Infiltration eosinophiler Granulozyten in die Atemwege war jedoch mit einer signifikanten Verringerung der Atemwegsreagibiltät gegenüber unspezifischen Stimuli assoziiert (Tab.). Damit wirkte sich die Applikation des CCR-3-Antagonisten vor allem auf die Infiltration eosinophiler Granulozyten in die Atemwege und damit einhergehend auf die Atemwegsreagibilität aus, ohne die OVA-spezifischen TH2 -Antwort zu beeinflussen.
Um nun die Rolle eosinophiler Granulozyten für das beim Asthma beobachtete Airway remodelling zu untersuchen, wurde eine Dosis von 30 mg/kg KG CCR-3-Antagonist eingesetzt, die die Infiltration dieser Zellen in die Atemwege wirksam verhindern sollte. Der Beginn der oralen Applikation des CCR-3-Antagonisten wurde dabei so gewählt, dass die Infiltration weiterer eosinophiler Granulozyten in die Atemwege unterbunden wurde, bevor im Mausmodell Anzeichen für einen fibrotischen Umbau der Atemwege zu beobachten war.
Nach vier Wochen Allergen-Exposition konnte in der BAL OVA-sensibilisierter Tiere noch eine große Anzahl eosinophiler Granulozyten (6,9 ± 0,72 Zellen/BAL) festgestellt werden. Die allergische Atemwegsentzündung war zudem mit einer im Vergleich zur PBS-Gruppe deutlich profunderen AHR assoziiert (Abb. 3.7.1).
Die Applikation des CCR-3-Antagonisten begann genau zu diesem Zeitpunkt und wurde bis zum Ende der zwölften Expositionswoche fortgeführt. Die unbehandelte OVA-Gruppe zeigte zu diesem Zeitpunkt eine deutlich geringere intraluminale Entzündung als vier Wochen zuvor, allerdings resultierte die fortwährende Allergenprovokation in einer massiven Entzündung des Atemwegsgewebes entlang des gesamten Bronchialsystems. Aus diesem Grund wurde zur Abschätzung der Effizienz der CCR-3-Antagonisierung neben der BAL auch die Lungenhistologie herangezogen.
0 2,5 5 7,5 10
PBS OVA
eosinophile G. (Zellen/BAL)
0 25 50 75 100
MCh50 (mg/ml)
A B
**
***
PBS OVA
Abb. 3.8.1 Einfluss des CCR-3-Antagonisten auf das experimentelle Asthma: A) Atemwegsreabilität gegenüber β-Methyl-Acetylcholin; B) Atemphysiologie
BALB/c Mäuse (je Gruppe n=8) wurden wie in Material und Methoden beschrieben mit OVA sensibilisiert und provoziert (siehe Abb. 2.2.3). Die Broncho-alveoläre Lavage fand 24 Stunden nach der letzten OVA-Exposition statt. Die Quantifizierung der eosinophilen Granulozyten wurde lichtmikroskopisch anhand zytologischer Kriterien durchgeführt. Die Atemwegsreabilität wurde 24 Stunden nach der letzten OVA-Exposition mittels Head-out Body-Plethysmographie bestimmt und wird als die Konzentration an β-Methyl-Acetylcholin (MCh50) ausgedrückt, die eine 50%ige Reduktion des Ausgangswerts des halbmaximalen expiratorischen Atemflusses bewirkt.
Dargestellt sind Mittelwerte ± S.E.M. (*** p < 0,001).
Die histologischen Lungenpräparate offenbaren in der OVA-Gruppe ein massives peribronchiales Infiltrat aus eosinophilen Granulozyten und Lymphozyten, wie es bereits zuvor beschrieben ist (siehe 3.5). Im Gegensatz dazu resultierte die Applikation des CCR-3-Antagonisten (CCR-3) in einer deutlichen Reduktion der
Anzahl infiltriender eosinophiler Granulozyten, während die Anzahl der in das Atemwesgewebe infiltrierten Lymphozyten unverändert blieb (Abb. 3.7.2).
Ein ähnliches Bild zeigt auch die Analyse der Leukozytensubpopulationen der BAL.
Abb. 3.8.2 Einfluss des CCR-3-Antagonisten auf die allergische Atemwegspathologie
BALB/c Mäuse (je Gruppe n=8) wurden wie in Material und Methoden beschrieben mit OVA sensibilisiert und provoziert (siehe Abb. 2.2.3). Die Applikation des CCR-3-Antagonisten fand über einen Zeitraum von der 4.-8. Provokationswoche statt. Die Lungen wurden durch Instillation von Formalinlösung entfaltet und in-situ fixiert. 3 µm dicke Paraffinschnitte wurden PAS-gefärbt.
Dargestellt sind repräsentative Querschnitte distale Atemwege der PBS-Gruppe (A) , der OVA-Gruppe (B) und der CCR-3-OVA-Gruppe (C). Balken = 100 µm.
Abb. 3.8.3 Einfluss des CCR-3-Antagonisten auf die allergische Atemwegsentzündung BALB/c Mäuse (je Gruppe n=8) wurden wie in Material und Methoden beschrieben mit OVA sensibilisiert, provoziert und mit CCR-3-Antagonisten behandelt (siehe Abb. 2.2.3). Die Broncho-alveoläre Lavage wurde 24 Stunden nach der letzten OVA-Exposition durchgeführt. Die Quantifizierung der Leukozyten wurde lichtmikroskopisch anhand zytologischer Kriterien durchgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte ± S.E.M. der unsensibilisierten (PBS) und sensibilisierten Kontrollgruppe (OVA), sowie der CCR-3-Gruppe (CCR-3) (*** p < 0,001).
A B C
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
PBS OVA CCR-3
eosinophile G. (Zellen/BAL)
0 0,2 0,4 0,6 0,8
PBS OVA CCR-3
Lymphozyten (Zellen/BAL)
Während in der BAL der OVA-Gruppe neben Lymphozyten (0,49 ± 0,06 x 105 Zellen/BAL) vor allem eosinophile Granulozyten (2,69 ± 0,55 x 105 Zellen/BAL) den Hauptanteil des leukozytären Infiltrats stellen, ist die Anzahl der eosinophilen Granulozyten nach CCR-3-Antagnisierung signifikant reduziert (0,95 ± 0,1 x 105 Zellen/BAL). Auch hier bleibt die Anzahl an Lymphozyten (0,49 ± 0,09 x 105 Zellen/BAL) in der BAL nahezu unbeeinflusst (Abb. 3.7.3).
A B C
D E F
Abb. 3.8.4 Einfluss des CCR-3-Antagonisten auf die allergische Atemwegspathologie
BALB/c Mäuse (je Gruppe n=8) wurden wie in Material und Methoden beschrieben mit OVA sensibilisiert und provoziert (siehe Abb. 2.2.3). Die Applikation des CCR-3-Antagonisten fand über einen Zeitraum von der 4.-8. Provokationswoche statt. Die Lungen wurden durch Instillation von Formalinlösung entfaltet und in-situ fixiert. 3 µm dicke Paraffinschnitte wurden PAS-gefärbt.
Dargestellt sind repräsentative Querschnitte distale Atemwege der PBS-Gruppe (A, D) , der OVA-Gruppe (B, E) und der CCR-3-OVA-Gruppe (C, F) in PAS- (A-C) bzw. Sirius red / Fast green (D-F) Färbung. Balken = 100 µm.