Die zu vermessenden Inhibitoren wurden in DMSO gelöst, sodass 10 mM-Stammlösungen erhalten wurden, deren Lagerung bei -20 °C erfolgte. Die darauf folgenden Verdünnungsstufen wurden mittels Messpuffer (50 mM Tris, 154 mM NaCl, pH 8.0) durchgeführt.
Substrate wurden, wenn nicht anders angegeben, in Reinstwasser gelöst, sodass 10 mM-Stammlösungen erhalten wurden. Die darauf folgenden Verdünnungsstufen wurden ebenfalls mit Reinstwasser durchgeführt.
Enzymverdünnungen wurden mit Enzymverdünnungspuffer (154 mM NaCl mit 0.1 % BSA) hergestellt.
Die Fluoreszenzmessungen wurden bei Raumtemperatur in schwarzen FluoroNunc F96 MaxiSorp Platten (Nunc, Langenselbold, Deutschland) an einem Fluoreszenz-Plattenleser Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) bei λex = 355 nm und λem = 460 nm durchgeführt. Der Start der Reaktion erfolgte durch die Zugabe des Enzyms, die Dauer einer Messung betrug 10 Minuten. Aus der Änderung der Fluoreszenz über die Dauer der Messung wurden Anstiege bestimmt (Fluoreszenz/t). Die Ansatzgröße betrug 140 µL und setzte sich aus 100 µL Puffer bzw. Inhibitorlösung in Puffer, 20 µL Enzymlösung und 20 µL Substratlösung zusammen.
Die Ki-Werte wurden mittels eines bereits beschriebenen[13] Assay bestimmt, die Konzentration der Matriptase im Ansatz betrug 23 pM. Als Substrat wurde Mes-D-Arg-Pro-Arg-AMC[193] (72, KM für Matriptase = 6 µM) mit Konzentrationen von 14, 7 und 3,5 µM im Ansatz verwendet. Die Ki-Werte wurden aus Dixon-Plots[182] ermittelt und stellen den Mittelwert aus mindestens zwei Messungen dar.
Für die Bestimmung der kinetischen Parameter von Substraten wurde der in Tabelle 29 gezeigte Messansatz verwendet.
Tabelle 29: Messansatz zur Bestimmung der kinetischen Parameter von Substraten der Matriptase.
Komponente Volumen c im Ansatz
Puffer 160 µL entfällt
Substrat 20 µL variiert
Enzym 20 µL 4,3 nM
Die Konzentrationen der Subtrate im Ansatz betrugen 5, 10, 15, 25, 40, 60, 80 und 100 µM.
Die Messungen wurden bei Raumtemperatur in schwarzen FluoroNunc F96 MaxiSorp Platten (Nunc, Langenselbold, Deutschland) an einem Fluoreszenz-Plattenleser Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) bei λex = 355 nm und λem = 460 nm
89 durchgeführt. Der Start der Reaktion erfolgte durch die Zugabe des Enzyms, die Dauer einer Messung betrug 10 Minuten. Aus der Änderung der Fluoreszenz über die Dauer der Messung wurden Anstiege bestimmt (Fluoreszenz/t). Diese Anstiege wurden mittels Origin 8.1 (OriginLab Corporation, Northhampton, Massachusetts, USA) gegen die Substratkonzentration aufgetragen und hieraus Km und Vmax bestimmt.
5.2.2 Thrombin
Die zu vermessenden Inhibitoren wurden in DMSO gelöst, sodass 10 mM Stammlösungen erhalten wurden, deren Lagerung bei -20 °C erfolgte. Die darauf folgenden Verdünnungsstufen wurden mittels Messpuffer (50 mM Tris, 154 mM NaCl, pH 8.0) durchgeführt.
Das Substrat Tos-Gly-Pro-Arg-AMC x TFA wurde in Reinstwasser gelöst, sodass eine 10 mM-Stammlösung erhalten wurde. Die darauf folgenden Verdünnungsstufen wurden ebenfalls mit Reinstwasser durchgeführt.
Enzymverdünnungen wurden mit Enzymverdünnungspuffer (154 mM NaCl mit 0,1 % BSA) hergestellt.
Die Fluoreszenzmessungen wurden bei Raumtemperatur in schwarzen FluoroNunc F96 MaxiSorp Platten (Nunc, Langenselbold, Deutschland) an einem Fluoreszenz-Plattenleser Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) bei λex = 355 nm und λem = 460 nm durchgeführt. Der Start der Reaktion erfolgte durch die Zugabe des Enzyms, die Dauer einer Messung betrug 10 Minuten. Aus der Änderung der Fluoreszenz über die Dauer der Messung wurden Anstiege bestimmt (Fluoreszenz/t). Die Ansatzgröße betrug 140 µL und setzte sich aus 100 µL Puffer bzw. Inhibitorlösung in Puffer, 20 µL Enzym-Lösung und 20 µL Substratlösung zusammen.
Die Ki-Werte wurden mittels eines bereits beschriebenen[13] Assay bestimmt, die Konzentration des Thrombins im Ansatz betrug 31 pM. Als Substrat wurde Tos-Gly-Arg-Pro-AMC (KM für Thrombin = 5,4 µM) mit Konzentrationen von 10, 5 und 2,5 µM im Ansatz verwendet. Die Ki-Werte wurden aus Dixon-Plots[182] ermittelt und stellen den Mittelwert aus mindestens zwei Messungen dar.
5.2.3 Faktor Xa
Die zu vermessenden Inhibitoren wurden in DMSO gelöst, sodass 10 mM-Stammlösungen erhalten wurden, deren Lagerung bei -20 °C erfolgte. Die darauf folgenden Verdünnungsstufen wurden mittels Messpuffer (50 mM TRIS, 154 mM NaCl, pH 8.0) durchgeführt.
Das Substrat Mes-D-Arg-Pro-Arg-AMC[193] wurde in Reinstwasser gelöst, sodass eine 10 mM-Stammlösung erhalten wurde. Die darauf folgenden Verdünnungsstufen wurden ebenfalls mit Reinstwasser durchgeführt.
90
Enzymverdünnungen wurden mit Enzymverdünnungspuffer (154 mM NaCl mit 0,1 % BSA) hergestellt.
Die Fluoreszenzmessungen wurden bei Raumtemperatur in schwarzen FluoroNunc F96 MaxiSorp Platten (Nunc, Langenselbold, Deutschland) an einem Fluoreszenz-Plattenleser Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) bei λex = 355 nm und λem = 460 nm durchgeführt. Der Start der Reaktion erfolgte durch die Zugabe des Enzyms, die Dauer einer Messung betrug 10 Minuten. Aus der Änderung der Fluoreszenz über die Dauer der Messung wurden Anstiege bestimmt (Fluoreszenz/t). Die Ansatzgröße betrug 140 µL und setzte sich aus 100 µL Puffer bzw. Inhibitorlösung in Puffer, 20 µL Enzym-Lösung und 20 µL Substratlösung zusammen.
Die Ki-Werte wurden mittels eines bereits beschriebenen Assays[13] bestimmt, die Konzentration des Faktor Xa im Ansatz betrug 97 pM. Als Substrat wurde
Mes-d-Arg-Pro-Arg-AMC[193] (KM für Faktor Xa = 28 µM) mit Konzentrationen von 50, 25 und 12,5 µM im Ansatz
verwendet. Die Ki-Werte wurden aus Dixon-Plots[182] ermittelt und stellen den Mittelwert aus mindestens zwei Messungen dar.
5.2.3.1 Berechnung der Ki-Werte aus IC50-Bestimmungen
Sofern Ki-Werte über den IC50-Wert bestimmt wurden, erfolgte dies nach dem folgenden, in Tabelle 30 beschriebenen Ansatz.
Tabelle 30: Messansatz zur Bestimmung des IC50-Wertes.
Komponente Konzentration Volumen c im Ansatz
Inhibitor oder Puffer --- 120 µL ---
Mes-DArg-Pro-Arg-AMC (72) 350 µM 20 µL 50 µM
Enzym 6,8 E-10 20 µL 9,7 E-11 M
Die Messung erfolgte mit jeweils acht verschiedenen Inhibitorkonzentrationen in einem Bereich von 1,0 × 10-6M bis 6,4 × 10-11M.
Die Fluoreszenzmessungen wurden bei Raumtemperatur in schwarzen FluoroNunc F96 MaxiSorp Platten (Nunc, Langenselbold, Deutschland) an einem Fluoreszenz-Plattenleser Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) bei λex = 355 nm und λem = 460 nm durchgeführt. Der Start der Reaktion erfolgte durch die Zugabe des Enzyms, die Dauer einer Messung betrug 10 Minuten. Aus der Änderung der Fluoreszenz über die Dauer der Messung wurden Anstiege bestimmt (Fluoreszenz/t). Daran anschließend wurden die Anstiege mittels Origin gegen die Inhibitorkonzentration aufgetragen und der IC50-Wert bestimmt. Die Berechnung der Ki-Werte erfolgte nach Formel 1.
91
Formel 1: Bestimmung des Ki aus dem IC50-Wert.
[S] ist hierbei die Substratkonzentration im Messansatz, KM ist die Michaelis-Menten-Konstante des verwendeten Substrates.
5.2.4 Kallikrein 7
Die zu vermessenden Inhibitoren wurden in DMSO gelöst, sodass 10 mM-Lösungen erhalten wurden, deren Lagerung bei –20 °C erfolgte. Die darauf folgenden Verdünnungsstufen wurden mittels KLK7-Puffer (0,1 M NaCl, 0,05 M TRIS, 0,005 % Tween 20, pH 8.0) durchgeführt.
Substrate wurden, wenn nicht anders angegeben, in Reinstwasser gelöst, sodass 10 mM-Stammlösungen erhalten wurden. Die darauf folgenden Verdünnungsstufen wurden ebenfalls mit Reinstwasser durchgeführt.
Enzymverdünnungen wurden, wenn nicht anders angegeben, mit KLK7-Puffer (0,1 M NaCl, 0,05 M TRIS, 0,005 % Tween 20, pH 8,0) hergestellt.
Die Fluoreszenzmessungen wurden bei Raumtemperatur in schwarzen FluoroNunc F96 MaxiSorp Platten (Nunc, Langenselbold, Deutschland) an einem Fluoreszenz-Plattenleser Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) bei λex = 355 nm und λem = 460 nm durchgeführt. Der Start der Reaktion erfolgte durch die Zugabe des Enzyms, die Dauer einer Messung betrug 10 Minuten. Aus der Änderung der Fluoreszenz über die Dauer der Messung wurden Anstiege bestimmt (Fluoreszenz/t).
5.2.4.1 Untersuchung von Substraten
Zur Bestimmung der kinetischen Parameter von Substraten wurde der in Tabelle 31 beschriebene Ansatz verwendet und mittels der voranstehenden Methode vermessen.
Tabelle 31: Messansatz zur Bestimmung der kinetischen Parameter von Substraten
Komponente Konzentration Volumen c im Ansatz Substrat oder Puffer variiert 100 µL variiert
Enzym Unbekanntc 20 µL Unbekannta
a Für das erhaltene Enzym waren keine Angaben zur Konzentration verfügbar. Eine active-site-Titration wurde nicht durchgeführt.
Es wurden jeweils mehrere Substratkonzentrationen vermessen (bei den Messungen angegeben) und die jeweiligen Anstiege (Fluoreszenz/t) bestimmt. Die kinetischen Parameter wurden mittels Michaelis-Menten-Auftragung oder Lineweaver-Burke-Auftragung bestimmt.
92
5.2.4.2 Bestimmung von Restaktivitäten
Tabelle 32: Messansatz zur Bestimmung der Restaktivität von KLK7.
Komponente Konzentration Volumen c im Ansatz Inhibitor oder Puffer Siehe
Messunga 100 µL Siehe
Messunga Mes-D-Arg-Pro-Tyr AMC
(119)b 350 µM 20 µL 50 µM
Enzym Unbekanntc 20 µL Unbekanntc
a Die Konzentration der vermessenen Inhibitoren im Ansatz ist bei der jeweiligen Messung angegeben
b Sofern andere Substrate verwendet wurden, sind diese bei der jeweiligen Messung angegeben
c Für das erhaltene Enzym waren keine Angaben zur Konzentration verfügbar. Eine active-site-Titration wurde nicht durchgeführt.
Die Bestimmung der Restaktivitäten erfolgte nach dem in Tabelle 32 gezeigten Ansatz. Die ermittelten Anstiege (siehe 5.2.4) von Puffer und Enzym wurden verglichen, der für den Puffer ermittelte Anstieg wurde gleich 100 % Restaktivität (ungehemmter Umsatz) gesetzt, die für die Inhibitoren ermittelten Werte wurden hierauf bezogen.
5.2.4.3 Bestimmung der Ki-Werte aus IC50-Bestimmungen
Sofern Ki-Werte über den IC50-Wert bestimmt wurden, erfolgte dies nach dem folgenden, in Tabelle 33 beschriebenen Ansatz.
Tabelle 33: Messansatz zur Bestimmung des IC50-Wertes
Komponente Konzentration Volumen c im Ansatz
Inhibitor oder Puffer --- 120 µL ---
Mes-D-Arg-Pro-Tyr AMC
(119) 350 µM 20 µL 50 µM
Enzym Unbekannta 20 µL Unbekannta
aFür das erhaltene Enzym waren keine Angaben zur Konzentration verfügbar. Eine active-site-Titration wurde nicht durchgeführt
Die Messung erfolgte mit jeweils acht verschiedenen Inhibitorkonzentrationen, in einem Bereich von 1 × 10-4M bis 6 × 10-9M.
Die Fluoreszenzmessungen wurden bei Raumtemperatur in schwarzen FluoroNunc F96 MaxiSorp Platten (Nunc, Langenselbold, Deutschland) an einem Fluoreszenz-Plattenleser Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) bei λex = 355 nm und λem = 460 nm durchgeführt. Der Start der Reaktion erfolgte durch die Zugabe des Enzyms, die Dauer einer Messung betrug 10 Minuten. Aus der Änderung der Fluoreszenz über die Dauer der Messung wurden Anstiege bestimmt (Fluoreszenz/t). Daran anschließend wurden die Anstiege mittels Origin gegen die Inhibitorkonzentration aufgetragen und der IC50-Wert bestimmt. Die Berechnung der Ki-Werte erfolgte nach Formel 1.
93