Enzymatische Reaktionsansätze

3.5.6.1 Herstellung von DMA-L-Abrin mit FgaPT2

Für die Herstellung von 4-DMA-L-Abrin aus L-Abrin mit FgaPT2 wurde ein 5 ml Ansatz angesetzt. Er enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM CaCl2, 1 mM L-Abrin, 2 mM DMAPP und 1 mg His8-FgaPT2. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 37 °C.

60 µl des Ansatzes wurden mit 1 Vol. Methanol abgestoppt, 10 min bei 10000 × g und 4 °C zentrifugiert und mittels HPLC analysiert. Als Standard diente 1 mM L-Abrin.

Der restliche Ansatz wurde ohne Zugabe von Methanol in 50 µl Aliquots aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.

3.5.6.2 Reaktionsansätze mit FgaDH-His6 und DMA-L-Abrin als Substrat

Der Standardansatz (100 µl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM des Kofaktors einzeln oder in Kombination und 5 µg FgaDH-His6. Dabei wurden die folgenden Kombinationen an Kofaktoren verwendet: FAD und NADH, FAD und NADPH, FMN und NADH, FMN und NADPH. Die Kofaktoren wurden in 50 mM Tris-HCl pH 7,5 gelöst und der pH gemessen und eventuell auf pH 7,5 nachjustiert. Als Substrat diente ein 50 µl Aliquot der Reaktion von FgaPT2 mit L-Abrin. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 37 °C.

Die Ansätze wurden mit 1 Vol. Methanol abgestoppt, 10 min bei 10000 × g und 4 °C

zentrifugiert und mittels HPLC analysiert. Als Standard diente ein Gemisch aus DMA-L -Abrin und Chanoclavin-I sowie die Reaktionsansätze mit Hitze-inaktiviertem FgaDH-His6. Dazu wurde das Protein für 30 min bei 100 °C erhitzt.

3.5.6.3 Reaktionsansätze mit FgaDH-His6 und Chanoclavin-I als Substrat

Der Standardansatz (100 µl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Chanoclavin-I, 5 mM NAD⁺ und 5 µg FgaDH-His6. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 37 °C. Die Ansätze wurden mit 1 Vol. Methanol abgestoppt, 10 min bei 10000 × g und 4 °C zentrifugiert und mittels HPLC analysiert. Als Kontrolle diente ein Reaktionsansatz mit Hitze-inaktiviertem FgaDH-His6.

Für die Messung der Ionenabhängigkeit wurden zu dem Standardansatz je 5 mM des entsprechenden Metallions bzw. EDTA gegeben. Als Kontrolle diente ein Standardansatz ohne Zugabe von Metallionen bzw. EDTA. Die Inkubation erfolgte für 1 h bei 37 °C.

Für die Abhängigkeit von der Proteinmenge wurden 0, 1, 2, 3, 5, 10, 25 µg FgaDH-His6 verwendet und die Ansätze 15 min inkubiert. Für die Abhängigkeit von der Zeit wurde der Standardansatz mit 1 µg FgaDH-His6 angesetzt und für 0, 4, 12, 20, 30, 50, 90 bzw. 150 min bei 37 °C inkubiert.

Für die Bestimmung der Michaelis-Menten Konstanten (KM-Wert) von Chanoclavin-I enthielten die Ansätze 10 mM NAD⁺, 1 µg FgaDH-His6 und 0, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1 und 2 mM Chanoclavin-I. Für die Bestimmung des KM-Werts von NAD⁺ enthielten die Ansätze 1 mM Chanoclavin-I, 1 µg FgaDH-His6 und 0, 0,15, 0,3, 0,5, 0,7, 1, 1,5, 3, 5 und 10 mM NAD⁺. Die Inkubation erfolgte jeweils für 15 min bei 37 °C.

3.5.6.4 Reaktionsansätze zur Isolierung des enzymatischen Produkts mit FgaDH-His6

Für die Isolierung des enzymatischen Produkts zur Strukturaufklärung wurde ein 20 ml Ansatz mit 2 mg FgaDH-His6 durchgeführt. Die Inkubation erfolgte für 4 h bei 37 °C. Anschließend wurde der Ansatz mit Ammoniumhydroxid auf pH 9 eingestellt und zweimal mit 2 Vol. Dichlormethan ausgeschüttelt. Die vereinten organischen Phasen wurden mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei einer Wasserbad-temperatur von 32 °C bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 400 µl Methanol aufgenommen und die Substanzen mittels HPLC isoliert.

3.5.6.5 Reaktionsansätze mit FgaOx3-His6

Bei den Tandeminkubationen wurde in der 1. Inkubation Chanoclavin-I mit FgaDH-His6

umgesetzt. Anschließend wurde der Reaktionsansatzes mit Natriumhydroxid auf pH 9 gebracht und der Ansatz zweimal mit 2 Vol. Ethylacetat extrahiert. Die vereinten Ethylacetatphasen wurden in einer Vakuumzentrifuge zur Trockene eingeengt und der Rückstand nach Resuspendieren in 2 µl DMSO als Substrat für die nächste Inkubation verwendet. Die 2. Inkubation enthielt standardmäßig 5 µg FgaOx3-His6, 5 mM FMN und/oder 5 mM NADH. Die Ansätze wurden mit 1 Vol. Methanol abgestoppt, 10 min bei 10000 × g und 4 °C zentrifugiert und mittels HPLC analysiert.

Der Standardansatz (100 µl) einer Koinkubation enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Chanoclavin-I, 5 mM NAD⁺, 5 µg FgaDH-His6, 5 µg aktives oder Hitze-inaktiviertes FgaOx3-His6, 5 mM FMN und/oder 5 mM NADH. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 30 °C. Anschließend wurde der Reaktionsansatz mit Natriumhydroxid auf pH 9 gebracht und der Ansatz zweimal mit 2 Vol. Ethylacetat extrahiert. Die vereinten Ethylacetatphasen wurden in einer Vakuumzentrifuge zur Trockene eingeengt und nach Resuspendieren des Rückstands in 100 µl Methanol mittels HPLC analysiert.

3.5.6.6 Reaktionsansätze zur Isolierung des enzymatischen Produkts mit FgaOx3-His6

Für die Isolierung des enzymatischen Produkts zur Strukturaufklärung wurde ein 20 ml Ansatz mit jeweils 1,5 mg FgaDH-His6 und FgaOx3-His6 durchgeführt. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 30 °C. Anschließend wurde der Ansatz mit Ammoniumhydroxid auf pH 9 eingestellt und zweimal mit 2 Vol. Ethylacetat ausgeschüttelt. Die vereinten organischen Phasen wurden mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei einer Wasserbadtemperatur von 32 °C bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 250 µl Methanol aufgenommen und die Substanzen mittels HPLC isoliert.

3.5.6.7 Reaktionsansätze mit FgaFS-His6

Bei den Tandeminkubationen wurde in der 1. Inkubation Chanoclavin-I mit FgaDH-His6

oder mit FgaDH-His6 und FgaOx3-His6 umgesetzt. Anschließend wurde der pH des Reaktionsansatzes mit Natriumhydroxid auf 9 gebracht und der Ansatz zweimal mit 2 Vol. Ethylacetat extrahiert. Die vereinten Ethylacetatphasen wurden in einer Vakuumzentrifuge zur Trockene eingeengt und der Rückstand nach Resuspendieren in 2 µl DMSO als Substrat für die nächste Inkubation verwendet. Die 2. Inkubation enthielt

5 mM FMN, 5 mM NADH, 5 µg FgaOx3-His6 und/oder 5 µg FgaFS-His6. Gegebenenfalls wurde eine 3. Inkubation mit 5 mM FMN, 5 mM NADH und 5 µg FgaFS-His6 durchgeführt.

Der Standardansatz (100 µl) einer Koinkubation enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Chanoclavin-I, 5 mM NAD⁺, 5 µg FgaDH-His6, 5 µg FgaOx3-His6 und aktives oder Hitze-inaktiviertes FgaFS-His6, 5 mM FMN und/oder 5 mM NADH. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 30 °C. Anschließend wurde der pH des Reaktionsansatzes mit Natriumhydroxid auf 9 gebracht und der Ansatz zweimal mit 2 Vol. Ethylacetat extrahiert. Die vereinten Ethylacetatphasen wurden in einer Vakuumzentrifuge zur Trockene eingeengt und nach Resuspendieren des Rückstands in 100 µl Methanol mittels HPLC analysiert.

3.5.6.8 Reaktionsansätze zur Isolierung des enzymatischen Produkts mit FgaOx3-His6 und FgaFS-His6

Für die Isolierung des enzymatischen Produkts zur Strukturaufklärung wurde ein 20 ml Ansatz mit jeweils 1,5 mg FgaDH-His6, FgaOx3-His6 und FgaFS-His6

durchgeführt. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 30 °C. Anschließend wurde der Ansatz mit Ammoniumhydroxid auf pH 9 eingestellt und zweimal mit 2 Vol.

Ethylacetat ausgeschüttelt. Die vereinten organischen Phasen wurden mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei einer Wasserbadtemperatur von 32 °C bis zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 250 µl Methanol aufgenommen und die Substanzen mittels HPLC isoliert.

3.5.6.9 Reaktionsansätze mit FgaPT1

Der Standardansatz (100 µl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 1 mM des jeweiligen Substrats, 2 mM DMAPP und 5 µg His6-FgaPT1. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 30 °C. Die Ansätze wurden mit 1 Vol. Methanol abgestoppt, 10 min bei 10000 × g und 4 °C zentrifugiert und mittels HPLC analysiert. Als Kontrolle dienten die Ansätze mit Hitze-inaktiviertem His6-FgaPT1.

3.5.6.10 Reaktionsansätze mit ChaDH-His6

Der Standardansatz (100 µl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Chanoclavin-I, 5 mM NAD⁺ und 5 µg ChaDH-His6. Die Inkubation erfolgte für 4 h bei 37 °C.

Anschließend wurde der pH-Wert des Reaktionsansatzes mit Natriumhydroxid auf 9

gebracht und der Ansatz zweimal mit 2 Vol. Ethylacetat extrahiert. Die vereinten Ethylacetatphasen wurden in einer Vakuumzentrifuge zur Trockene eingeengt und nach Resuspendieren des Rückstands in 100 µl Methanol mittels HPLC analysiert. Als Kontrolle diente ein Reaktionsansatz mit Hitze-inaktiviertem ChaDH-His6. Der Ansatz für die Kontrolle der Rückreaktion (100 µl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), circa 1 mM isoliertes Chanoclavin-I-Aldehyd, 5 mM NADH und 5 µg ChaDH-His6.

Für die Messung der Ionenabhängigkeit wurden zu dem Standardansatz je 5 mM des entsprechenden Metallions bzw. EDTA gegeben. Als Kontrolle diente ein Standardansatz ohne Zugabe von Metallionen bzw. EDTA. Die Inkubation erfolgte für 1 h bei 37 °C.

Für die Abhängigkeit von der Proteinmenge wurde 0, 1, 2, 3, 5, 10, 25 µg ChaDH-His6 verwendet und die Ansätze 10 min inkubiert. Für die Abhängigkeit von der Zeit wurde der Standardansatz mit 1 µg ChaDH-His6 angesetzt und für 0, 4, 12, 20, 30, 50, 90 bzw. 150 min bei 37 °C inkubiert.

Für die Bestimmung des KM-Werts von Chanoclavin-I enthielten die Ansätze 10 mM NAD⁺, 1 µg ChaDH-His6 und 0, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1 und 2 mM Chanoclavin-I.

Für die Bestimmung des KM-Werts von NAD⁺ enthielten die Ansätze 1 mM Chanoclavin-I, 1 µg ChaDH-His6 und 0, 0,15, 0,3, 0,5, 0,7, 1, 1,5, 3, 5 und 10 mM NAD⁺. Die Inkubation erfolgte jeweils für 10 min bei 37 °C.

3.5.6.11 Reaktionsansätze zur Isolierung des enzymatischen Produkts mit ChaDH-His6

Für die Isolierung des enzymatischen Produkts zur Strukturaufklärung wurde ein 20 ml Ansatz mit 2 mg ChaDH-His6 durchgeführt. Die Inkubation erfolgte für 3 h bei 37 °C. Anschließend wurde der Ansatz mit Natriumcarbonat auf pH 9 eingestellt und zweimal mit 2 Vol. Dichlormethan ausgeschüttelt. Die vereinten organischen Phasen wurden mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei einer Wasserbadtemperatur von 32 °C bis zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 400 µl Methanol aufgenommen und die Substanzen mittels HPLC isoliert.