Enzymassay von Gesamtzellextrakt aus Phaeodactylum tricornutum Die Plastiden, wie auch die Mitochondrien von P. tricornutum lassen sich beim

Aufbrechen der Zellen sehr schlecht isolieren. Daher wurde für die enzymatischen Assays der Gesamtextrakt der P. tricornutum untersucht und so in Kauf genommen, daß im Enzymassay die cytosolische FBPase (23247) durch ihre enzymatische Reaktion die ermittelten Aktivitäten der plastidären FBPasen (C1 42886, C2 42456,

C3 31451, C4 54279) beeinflusst. Der pH-Wert spielt bei der in vitro Aktivierung der plastidären FBPasen durch TrxF eine besondere Rolle. Deswegen wurde zur Reduzierung der plastidären FBPasen von P. tricornutum der pH-Wert in den Präinkubationsansätzen bei 7,5 gewählt. Damit der Cofaktor Mg²⁺ nicht inhibierend wirkt, wurde in den Präinkubationsansätzen eine Mg²⁺ Konzentration von nur 2,5 mM gewählt. Da das Substrat (Fruktose-1,6-Bisphosphat) eine Verunreinigung bis zu 4%

von anderen Fruktosen beinhaltete, wurde in den Präinkubationsansätzen kein Substrat zur Aktivierung dazugegeben. Diese anderen Fruktosen können durch die gekoppelte Enzyme (PGI, Phosphoglucose Isomerase, GPDH Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase) im Reaktionsansatz enzymatisch umgesetzt werden (siehe Abbildung 5). Die Temperatur spielt ebenfalls eine Rolle für die Enzymaktivität der cytosolischen und der plastidären FBPasen. Die cytosolische FBPase verträgt keine tiefen Temperaturen zwischen 0°C und 12°C, wenn anschließend bei 22°C ein Enzymassay gemessen wird. Nur wenn vor der Messung die cytosolische FBPase mindestens 40 Minuten sich auf etwa Raumtemperatur (RT) einstellen konnte, war eine normale Enzymaktivität wieder erreicht. In diesem Ansatz wird das durch die FBPase umgesetzte Fruktose-6-Phosphat zuerst durch die PGI in Glukose-6-Phosphat isomerisiert. Durch die Anwesenheit von NADP⁺ kann die GPDH Glukose-6-Phosphat in Gluconat-Glukose-6-Phosphat katalytisch umsetzen. Die Reduktion der NADP⁺ zu NADPH verhält sich stöchiometrisch 1:1 mit der Dephosphorylierung von Fruktose-1,6-Bisphosphat zu Fruktose-6-P.

In dem Gesamtzellextrakt von P. tricornutum werden alle fünf vorhandenen FBPasen gemessen, die cytosolische FBPase (23247), die zwei plastidären FBPasen (C1 42886, C4 54279) und die zwei anderen plastidären FBPasen (C2 42456, C3 31451), welche jeweils zwei Cysteine in ihren regulativen Zentren haben (siehe Kapitel 1). Die FBPasen im Gesamtzellextrakt haben schon eine Grundaktivität (siehe Abbildung 6), diese kann eventuell zum einem daher kommen, da noch Fruktose-1,6-Bisphosphat, Fruktose-6-Phosphat oder Glucose-6-Phosphat im Extrakt vorhanden war, zum anderem FBPase oder die gekoppelten Enzyme (PGI und GPDH) die Fructose-6-Phosphat oder Glucose-6-Phosphat verwerteten.

Wenn der Zellextrakt zentrifugiert oder über eine Sephadex G25 Säule (Amersham) entsalzt wurde, war keine Enzymaktivität der FBPasen von P. tricornutum im Überstand oder im Durchfluss mehr zu messen (siehe Abbildung 10). Es wurden alle FBPasen auf Löslichkeit mit bioinformatischen TMHMM Vorhersagen getestet

(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) (Krogh et al. 2001, Sonnhammer et al.

1998), aber es konnten keine membranintegrierten Bereiche identifiziert werden.

Abb. 5: Reaktionsschema des Enzymassays mit der Fructose-1,6-Bisposphatase. Bei der enzymatischen Reaktion der FBPase von Fructose-1,6-Bisphosphat zu Fructose-6-Bisphosphatwird nach zwei weiteren enzymatischen Reaktionen NADP⁺ zu NADPH reduziert. Dies kann zeitgleich bei 340 nm im Photometer gemessen werden (Kelly et al. 1982, Nishizawa et al. 1982). FBP Fructose-1,6-Bisphosphatase, PGI Glucose-6-phosphate Isomerase, GPDH Glucose-6-phosphate Dehydrogenase.

Die Aktivität der FBPasen nimmt mit zunehmender Substratkonzentration ab (siehe Abbildung 6), dies deutet auf eine Hemmung des Produktes hin. Die höchste Aktivität haben die FBPasen zusammen bei 200 µM Substrat (siehe Abbildung 6 und 7) und pH 8,0 (siehe Abbildung 9). Bei pH 7 ist ein 20%iger und pH 9 sogar ein 40%iger Aktivitätsverlust zu beobachten.

Bei der Aktivitätskurve der FBPasen auf Fructose-1,6-Bisphosphat nach Lineweaver/Burk kann Vmax und der KM aus der Geradengleichung (siehe Abbildung 7) errechnet werden. Der y-Achsenabschnitt ist 1/Vmax mit 1044,2 daraus ergibt sich dann Vmax mit etwa 0,0010 µmol/(min*mg Gesamtzellproteine). KM ist der Schnittpunkt der Geraden bei der x-Achse mit -1/KM, dies ergibt dann ein KM von 10,77 µM Substrat, bzw. Vmax/2 bei etwa 0,005 µmol/(min*mg Gesamtzellproteine).

Bei der Aktivitätskurve (Abbildung 6) ist eine leichte sigmoide Steigung zu erkennen, dies kann auf allosterische Enzyme hindeuten. Die gesamten FBPasen haben eine optimale Enzymaktivität bei 10 mM Mg²⁺ und pH 8,0 (Abbildung 8). Außerdem kann die Aktivität der FBPasen im Gesamtzellextrakt von P. tricornutum durch reduziertes DTT gesteigert oder durch oxidiertes DTT minimiert werden (siehe Abbildung 10).

Abb. 6: Enzymatische Aktivität der FBPasen im Gesamtzellextrakt von Phaeodactylum tricornutum. Die niedrigen Aktivitätseinheiten resultieren aus der Berechnung der Aktivität, bezogen auf die Gesamtproteinkonzentration. Jede Messung wurde dreimal wiederholt (n=3), die Balken sind Standardabweichungen.

Die Behandlung erfolgte mit 50 mM DTT. Dies deutet darauf hin, daß einige FBPasen reduzierbar sind, wahrscheinlich die vorhergesagten FBPC2 und FBPC3.

Bei der rekombinanten FBPC3 konnte dies durch die in vitro Reduktion gut gezeigt werden (Abbildung 4).

Abb. 7: Enzymatische Umsetzung von Bisphosphat durch Fruktose-1,6-Bisphosphatasen aus dem Gesamtzellextrakt von Phaeodactylum tricornutum als Lineweaver/Burk Berechnung (siehe Abb. 6). Jede Messung wurde dreimal wiederholt (n=3).

Wurden die FBPasen (C1, C2, C3, C4 und die cytosolische FBPase) nicht mit DTT reduziert, (Abbildung 10), war ein Aktivitätsverlust von fast 90% zu beobachten.

Die plastidären FBPasen können durch Ca²⁺ inhibiert werden (Charles und Halliwell 1980), ähnlichen inhibierenden Effekt konnte auch bei dem Gesamtzellextrakt gemessen werden (Abbildung 10). Dort fiel die Aktivität um fast 60% ab, wenn die FBPasen mit 20 mM Ca²⁺ und gleichzeitig mit 50 mM reduziertem DTT behandelt wurden. Wenn der Überstand des Gesamtzellextraktes nach einer 20 minütigen Zentrifugation (20000 x g) mit 50 mM reduziertes DTT inkubiert und die Enzymaktivität gemessen wurde, fiel die Gesamtaktivität um etwa 80% ab (Abbildung 10).

Abb. 8: Enzymatische Umsetzung von Fructose-1,6-Bisphosphat durch die FBPasen aus dem Gesamtzellextrakt von Phaeodactylum tricornutum bei verschiedenen Mg²⁺ Konzentrationen.

Jede Messung wurde dreimal wiederholt (n=3), die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.

Abb. 9: Effekt der Enzymaktivität der Fruktose-1,6-Bisphosphatasen aus dem Gesamtzellextrakt von Phaeodactylum tricornutum auf verschiedene pH Werte. Jede Messung wurde dreimal wiederholt (n=3), die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.

Abb. 10: Effekt der Enzymaktivität der Fruktose-1,6-Bisphosphatasen (FBPase) aus dem Gesamtzellextrakt von Phaeodactylum tricornutum auf reduziertes und oxidiertes DTT, auf den Inhibitor Ca²⁺ für plastidäre FBPasen und aus dem Überstand von zentrifugierten Gesamtzellextrakt. Jede Messung wurde dreimal wiederholt (n=3), bzw. sechsmal (n=6) bei der Behandlung mit reduziertem DTT. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.

2.4 Gentranskription Analyse der Calvin Zyklus Enzyme mit der Real-Time