4.3 Entwicklung einer chromatographischen Methode zur
In Abbildung 4.1 ist die Vorgehensweise bei der Reinigung mittels kovalenter Affinitäts-chromatographie schematisch dargestellt.
+ + + + + + +
+ + + + + + + SH
SH
GSSG
SSG SSG
+ + + + + + + + + + + + + +
S-Protein
-Protein
-+ -+ -+ -+ -+ -+ -+
+ + + + + + + SSG
SS -Protein - - - -Protein
Protein
-Protein -SS
SSG
+ + + + + + + + + + + + + +
+ NaCl Protein
-Protein SS
SSG
+ + + + + + + + + + + + + +
-- --
-- -- -- -- -- -- -- -- --
+ + + +
+ + +
+
+ +
++ - -
-- -
-+
-+
+
-+ NaCl -+ RS
-- - -
-- -+ + +
- - - + + + + + + +
+ + + + + + + S
- S
-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- Protein S
--
-+
+ +
Abb. 4.1: Prinzip der kovalenten Affinitätschromatographie. Die Cystein-Reste der an den Träger gekoppelten polyionischen Peptide werden zunächst mit oxidiertem Glutathion in gemischte Disulfide überführt. Im nächsten Schritt werden Proteine mit komplementär geladenen Fusionspeptiden auf die Säule aufgetragen. Proteine mit unvollständigen Fusionspeptiden bzw. negativ geladene Fremd-proteine interagieren ausschließlich über ionische Wechselwirkungen mit dem Gelmaterial. Proteine mit vollständigem Fusionspeptid bilden, vermittelt durch die ionische Wechselwirkung, gezielt eine Disulfidbrücke mit der Matrix aus. Während das ionisch gebundene Protein durch Erhöhung der Ionenstärke des Eluenten abgelöst wird, erfordert die Elution des kovalent immobilisierten Proteins den Zusatz eines Reduktionsmittels RS-, z. B. DTT oder L-Cystein.
Die Methode konnte erfolgreich für die Charakterisierung von FabE10C und α-GlucE10C eingesetzt werden. Beide Proteine wurden kovalent am Trägermaterial immobilisiert und konnten nach Reduktion der Disulfidbrücke unter Hochsalzbedingungen eluiert werden. Da sich in beiden Fällen der Cystein-Rest C-terminal hinter der polyionischen Sequenz befindet, ist daraus zu folgern, daß die C-terminalen Fusionspeptide der solchermaßen isolierten Proteine vollständig sind. Kontrollexperimente mit nicht-modifizierter α-Glucosidase belegen, daß keine unspezifische Ausbildung von Disulfidbrücken mit einem der fünf freien Cystein-Reste der Primärsequenz erfolgte. Während α-GlucE10C nach Elution unter reduzierenden Hochsalzbedingungen quantitativ zurückgewonnen wurde, lagen die Verluste des FabE10C-Fragmentes bei 34 %. In einer ähnlichen Größenordnung liegen die Verluste bei der Aufreinigung von Fab-Fragmenten an Resource Q (vgl. Abschnitt 3.1.1). Vermutlich interagieren die Antikörperfragmente zusätzlich unspezifisch mit dem Trägermaterial. Eine
Beeinträchtigung der Antikörperfunktionalität durch die kurzzeitige Exposition gegenüber reduzierenden Reagenzien konnte nicht festgestellt werden. Unter den gewählten Elutionsbedingungen 10 mM L-Cystein (Inkubationszeit: 1 h bei 4°C) wurden die für eine funktionelle Struktur entscheidenden intrachenaren Disulfidbrücken der immunglobulin fold-Domänen nicht reduziert.
Für eine Charakterisierung von Proteinen mit polyanionischen Fusionspeptiden im präparativen Maßstab ist die entwickelte Methode geeignet. Begrenzt ist derzeit der Einsatz für eine selektive Reinigung von Proteinen aus einem Rohextrakt. Aufgrund der Kompetition durch Wechselwirkung der DNA mit den Lysinpeptiden des Trägermaterials ist die geringe ionische Kapazität sehr schnell erreicht, so daß nur geringe Mengen an Protein isoliert werden konnten. Der Aufreinigungsfaktor liegt dabei bei 73.
Daher ist es anzustreben, die Beladungsdichte des Trägermaterials weiter zu erhöhen. An der verwendeten CNBr-aktivierten Sepharose fast flow können nach Angaben des Herstellers pro ml Matrix maximal 13-26 mg α-Chymotrypsinogen immobilisiert werden. Daraus folgt für eine Ein-Punkt-Fixierung der α-Chymotrypsinogen-Moleküle (22 kD) eine Menge an aktivierten Gruppen von mindestens 0,6-1,2 µmol/ml. Diese wurden im vorliegenden Fall vermutlich nur zu etwa 30 % für die Kopplung der ACK8A-Peptide ausgenutzt (220 nmol gekoppeltes Lysinpeptid/ml Matrix). Die Kapazität der Säule für gereinigte α-GlucE10C wurde zu 12 nmol/ml Gelmaterial ermittelt. Mit Hilfe von Bindungsexperimenten wurde die Kooperativität der Interaktion zwischen den polyionischen Fusionspeptiden und den an der Matrix immobilisierten Peptiden untersucht. Die Auswertung der experimentellen Daten mit der empirisch ermittelten Beziehung nach Hill resultiert in einer Kooperativitätskonstanten von 5,1 ± 0,9. Die Kooperativität der Wechselwirkung ist somit ähnlich wie die Interaktion von α-GlucE10C mit dem Gelmaterial Fractoprep DEAE. Dieses wurde für die Matrix-unterstützte Renaturierung verwendet. Die Kooperativitätskonstante gibt unter den vorliegenden Versuchsbedingungen an, wie viele monovalente Gegenionen für eine vollständige Dissoziation der komplementär geladenen polyionischen Peptide erforderlich sind. Die an die Gelmatrix gekoppelten Lysinpeptide haben maximal 7 positive Nettoladungen. Berücksichtigt man zusätzlich die negative Ladung des partiell deprotonierten Cystein-Restes, so sind die vorhandenen positiven Ladungen nahezu vollständig an der Interaktion beteiligt.
Ebenso wie die Sepharose-ACK8A-Säule wurde eine Sepharose-ACE10 hergestellt und für die Reinigung eines Proteins mit komplementär geladenem Fusionspeptid verwendet. Im Fall
der α-Glucosidase-Variante R10C-α-Gluc wurde allerdings festgestellt, daß das mittels konventionellem Kationenaustauscher vorgereinigte Protein zwar über ionische Wechselwir-kungen mit der Sepharose-ACE10 interagierte, jedoch nicht quantitativ gekoppelt werden konnte. Aufgrund der ionischen Interaktion von Gelmaterial und Fusionsprotein ist davon auszugehen, daß die geladenen Aminosäuren der polyionischen Peptide zumindestens partiell vorhanden sind. Das bedeutet implizit, daß die Cystein-Reste vorhanden sind, da sie sich zum einen in umittelbarer Matrixnähe befinden und im Falle des Fusionsproteins zwischen der N-terminalen polyionischen Sequenz und dem Fusionsprotein eingefügt wurden. Für das Ausbleiben der kovalenten Verknüpfung mittels Disulfidbrücke kommen daher zwei Erklärungsmöglichkeiten in Betracht: zum einen die sterische Hinderung aufgrund der Position der Reste und zum anderen eine herabgesetzte Reaktivität des Cystein-Restes der Matrix. Dieser Cystein-Rest befindet sich in direkter Nachbarschaft zu negativ geladenen Glutaminsäure-Resten, und wurde unter den vorliegenden Bedingungen möglicherweise nicht in ein gemischtes Disulfid mit dem ebenfalls negativ geladenen Glutathion überführt. Im Fall der Kopplung von α-GlucE10C an Sepharose-ACK8A wurde der den positiven Ladungen benachbarte Cystein-Rest in ein gemischtes Disulfid überführt.
Der nachfolgende nucleophile Angriff des C-terminalen Cystein-Restes von α-GlucE10C erfolgte von Seiten des Thiolatanions, in dessen unmittelbarer Nachbarschaft weitere negative Ladungen vorhanden waren. Im vorliegenden Fall ist die Situation genau entgegengesetzt.
Das läßt vermuten, daß die Position des Cystein-Restes im polyionischen tag bzw. innerhalb der an die Matrix gekoppelten Peptide eine Rolle spielt.
Um zwischen der sterischen Hinderung und der veränderten Reaktivität des Cystein-Restes als mögliche Ursache für die ausbleibende kovalente Kopplung unterscheiden zu können, könnte die Position des Cystein-Restes in den synthetischen Peptiden variiert werden, so daß z. B. eine Sepharose-AE10C mit C-terminalem Cystein-Rest zur Verfügung steht.
Desweiteren könnten die synthetischen Peptide durch Anfügen eines hydrophilen Linkers an den N-Terminus flexibler gestaltet werden. Dieser Linker könnte beispielsweise aus Glycin und/oder Serin-Resten bestehen. Möglicherweise ist die Reaktivität des Cystein-Restes der mit negativ geladenen Peptiden modifizierten Matrix herabgesetzt, so daß unter den gewählten Bedingungen kein gemischtes Disulfid mit dem ebenfalls negativ geladenen GSSG ausgebildet wird. Nach Immobilisierung der polykationischen Fusionsproteine über ionische Wechselwirkungen könnte die Ausbildung der Disulfidbrücke in Gegenwart eines oxido-shuffling-Systems durchgeführt werden.
Es wurde eine chromatographische Methode zur selektiven Reinigung und Charakterisierung von Proteinen mit polyanionischen Fusionpeptiden entwickelt. Diese Methode wurde als kovalente Affinitätschromatographie bezeichnet und beruht auf der Verwendung eines "mixed mode adsorbents". Für eine Charakterisierung und Feinreinigung von Proteinen im präparativen Maßstab ist das zur Zeit zur Verfügung stehende Gelmaterial geeignet. Für die präparative Reinigung von Proteinen aus einem Rohextrakt müßte die Dichte funktioneller Gruppen weiter erhöht werden.
4.4 Bildung eines Antikörperfragment-Enzym-Konjugates durch gerichtete