Energetische Betrachtung des Bindungsvorganges

Die reversible Bindung eines Liganden an ein Protein zu einem Protein-Ligand-Komplex wird im thermodynamischen Gleichgewicht durch das Massenwirkungsgesetz beschrieben.

Gleichung 6

[ ]

[ ][ ]

P L K = PL

Dabei sind die Ausdrücke [P]_tot und [L]_tot wie folgt definiert:

Isothermale Titrationskalorimetrie 159

Gleichung 7

[ ] [ ] [ ]

^L tot= ^L + ^PL

Gleichung 8

[ ]

^{P tot=}

[ ] [ ] [ ] [ ]

^{PL + P = PL +KPL⋅}

[ ]

^L

Aus diesen Gleichungen erkennt man, dass sich die Gesamtkonzentration des Liganden in der Messzelle aus der Summe der Konzentrationen des freien und des gebundenen Liganden zusammensetzt. Analog dazu setzt sich die Gesamtkonzentration an Protein aus der ungebundenen und der komplexierten Menge zusammen. Zusätzlich ist in Gleichung 8 die Konzentration des freien Proteins durch den Term, der sich nach Umstellung des Massenwirkungsgesetzes ergibt, ersetzt. Anschließend wird Gleichung 7 nach [L] aufgelöst und in Gleichung 8 eingesetzt. Durch weitere mathematische Operationen erhält man folgende quadratische Gleichung:

Gleichung 9

[ ] [ ] [ ]

²

[ ]

¹ ⁺

[ ] [ ]

⁼⁰



 



− − −

+ _{tot tot} P _tot L _tot L K

P PL PL

Die positive Wurzel dieser Gleichung lautet:

Gleichung 10

[ ]

2

2 4a

b PL −b− −

=

mit

Gleichung 11

[ ] [ ]

L K P

b _{tot tot} 1

−

−

−

=

und

Gleichung 12 a=

[ ] [ ]

P _tot L _tot

Im nächsten Schritt wird die Konzentration des Protein-Ligand-Komplexes [PL] nach der Gesamtkonzentration des Liganden [L]_tot abgeleitet. Nach Umstellung der erhaltenen Gleichung ergibt sich:

Gleichung 13

[ ]

[ ]

² ₂ ²

₍

₁

_{) (}

² ₁

₎

²

1 1

2 1

r r

X X

X r L

d PL d

r r

r

tot − − + +

+ − + −

=

mit

Gleichung 14 r= K

[ ]

1P _tot

und

Gleichung 15

[ ]

[ ]

tot tot

r P

X = L

Ziel der mathematischen Umformungen ist es, einen Zusammenhang zwischen der freigesetzten bzw. absorbierten Wärmemenge Q und den Konzentrationen in der Messzelle zu finden. Q hängt von folgenden Faktoren ab:

a) Zellvolumen V

b) molare Bindungsenthalpie ∆H c) Stöchiometrie

d) Menge des eingespritzten Liganden e) Konzentrationen in der Messzelle

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass mit der Abnahme an unkomplexiertem Protein die freigesetzte Wärmemenge verringert wird, ergibt sich die nachfolgende Gleichung. Dabei ist die Abnahme der Anzahl unbesetzter Bindetaschen antiproportional zur Konzentrationsänderung des Protein-Ligand-Komplexes d[PL].

Gleichung 16 dQ =d

[ ]

PL ⋅∆H⋅V

Der Term d[PL] fasst dabei die Faktoren c), d) und e) zusammen, von denen die Wärmemenge Q abhängig ist.

Isothermale Titrationskalorimetrie 161 Die Gleichung zeigt, dass die Änderung der Konzentration von [PL] der Änderung von Q proportional ist. Dies bedeutet, dass je größer die Änderung von [PL] ist, desto größer ist die umgesetzte Wärmemenge und umgekehrt.

Die Änderung der Konzentration von [PL] wurde bereits in Gleichung 13 beschrieben. Durch Substitution in Gleichung 16 erhält man:

Gleichung 17

[ ] _{( ) ( )}

_













+ +

−

− + − + −

∆

=

⋅ 2 2

1 1

2

2 2 1 1

2 1 1

r r

X X

X r L H

d dQ

V r r

r

tot

Diese Beziehung beschreibt die Bindungsreaktion zwischen einem Protein und einem Liganden im Verhältnis 1:1 und ist ein Ausdruck für die umgesetzte Wärmemenge.

Bei einer starken Bindung zwischen Protein und Ligand, d.h. hohen K-Werten, werden bei jeder Zugabe die Ligandmoleküle sofort quantitativ gebunden. Die freigesetzte Wärmemenge bleibt gleich, da sie bei überschüssiger Enzymkonzentration nur von der Anzahl an eingespritzten Ligandmolekülen abhängt. Dieser Vorgang wiederholt sich bis zur kompletten Sättigung des Enzyms. Überschreitet man den Äquivalenzpunkt, so wird, da keine Bindungen mehr geknüpft werden, auch keine Wärme mehr freigesetzt. Der dennoch beobachtete Wärmeumsatz muss demnach auf andere Phänomene, wie z.B. Verdünnungseffekte zurückzuführen sein. Bei hohen K-Werten hat die Titrationskurve die Form einer Stufenfunktion, deren Höhe ∆H entspricht.

Bei kleineren Werten für K nimmt die freigesetzte Wärmemenge ab, sobald man sich dem Sättigunspunkt der Titration nähert. Dies kommt dadurch zustande, dass nicht mehr alle Ligandmoleküle quantitativ gebunden werden. Beim Übergang zu kleineren Werten für K geht also die Bindungskurve aufgrund der eben beschriebenen Phänomene in eine sigmoidale Form über. Bei zu kleinen K-Werten erhält man fast eine Horizontale. Aus solch flachen Kurven lassen sich keine Informationen über K mehr entnehmen.

Simulierte Bindungskurven bezüglich der Gleichung 17 sind in Abbildung 33 dargestellt. Für die Interpretation dieser Kurven wird ein zusätzlicher Parameter c eingeführt, der reziprok zum Wert r aus Gleichung 14 ist.

Gleichung 18 K

[ ]

P _tot

c=1r =

Bei einer sehr starken Bindung (c = ∞) des Liganden L an das Protein P werden alle Moleküle des Liganden sofort gebunden, bis die Sättigung des Proteins eintritt, d.h. bis alle katalytischen Zentren besetzt sind. Als Bindungskurve ergibt sich dann eine Stufenfunktion mit der Höhe

∆H.

∆H

0.01 1

5

40 500

∞

1 2

0 [L]

_tot

/[P]

_tot

0.5

Abbildung 33. Simulierte Bindungsisotherme nach Gleichung 17 für verschiedene Parameter c = K [P]tot. Die Werte für c sind in der Abbildung dargestellt.

Für relativ starke Ligandenbindungen mit c = 10 - 500 geht diese Stufenfunktion in eine sigmoidale Kurve über, deren Verlauf stark von dem Parameter c abhängt. Schwache Ligandenbindungen ergeben fast horizontale Bindungskurven (c < 5), die nur wenig Informationen über die Bindungskonstante K enthalten. Der c-Wert und die Bindungskonstante K sind direkt proportional zueinander. Große c-Werte sprechen daher für eine hohe Bindungskonstante, kleine c-Werte für eine niedrige.

Aus diesen Überlegungen ergibt sich zwangsläufig, dass bei großen Bindungskonstanten nur geringe Proteinkonzentrationen eingesetzt werden können, wenn man den oben genannten Bereich geeigneter c-Werte nicht verlassen möchte. Der Einsatz einer geringeren Proteinkonzentration führt aber im Gegenzug zu einer Verringerung der insgesamt freigesetzten Wärmemenge. Daher ist es unter Umständen möglich, dass bei einer solchen Messanordnung das Detektionslimit des Messgerätes unterschritten wird und dadurch eine Messung unmöglich wird.

Isothermale Titrationskalorimetrie 163 6.3.3 Bestimmbare Größen

Die Messgrößen, die aus einer einzigen ITC-Messung erhalten werden können, sollen im folgenden Abschnitt kurz erläutert werden. Um diese Daten mittels einer anderen Methode zu bestimmen, sind mehrere Messungen unter unterschiedlichen Bedingungen erforderlich.

Das Messsignal der ITC ist, wie oben beschrieben, der Heizstrom zum Erwärmen der Messzelle, angegeben in µcal/s, aufgetragen gegen die Zeit. Es resultiert eine Kurve wie in Abbildung 34 (oben).

-0,6 -0,4 -0,2 0,0

0 10 20 30 40 50 60 70

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

-6 -4 -2 0

Molares Verhältnis Zeit (min)

µcal/seckcal/mol pro Injektion

Abbildung 34. Ergebnis einer ITC-Messung. Die obere Hälfte zeigt die Rohdaten einer typischen ITC Messung. Jeder Peak steht für eine Injektion. Nach der vollständigen Sättigung des Proteins zeigen die letzten Peaks nur die Wärmetönung, die durch die Verdünnung des Liganden in der Zelle entsteht. Die Messpunkte in der unteren Hälfte der Abbildung sind jeweils das Integral der obigen Peaks. Die durchgezogene Kurve repräsentiert das Ergebnis der Kurvenanpassung nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate.

Anschließend wird mittels eines Computers das Integral der einzelnen Peaks zwischen Basislinie und Kurvenverlauf gebildet. Dieses wird dann gegen das molare Verhältnis von Ligand zu Protein aufgetragen, wie in Abbildung 34 (unten) dargestellt.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-5 -4 -3 -2 -1 0

Molares Verhältnis

kca l/mol p ro In jektion

Stöchiometrie

∆G

∆H

Abbildung 35. Auswertung einer ITC Messung. Die Messpunkte in der Abbildung entsprechen jeweils dem Integral der Messsignale. Die durchgezogene Kurve repräsentiert das Ergebnis der Kurvenanpassung nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate. Der Achsenabschnitt auf der Ordinate repräsentiert die Bindungsenthalpie ∆H, aus dem Kurvenverlauf lässt sich die Freie Bindungsenthalpie ∆G und somit auch die Bindungskonstante K bestimmen.

Den sigmoidalen Kurvenverlauf erhält man mittels einer mathematischen Fit-Funktion (Gleichung 17), mit deren Hilfe die Kurve an die erhaltenen Messpunkte angepasst wird. Die Berechnung der Kurve erfolgt vollautomatisch mit Hilfe eines PCs und einer entsprechenden Software. Aus dem Kurvenverlauf berechnet der PC den Wert der Bindungskonstante K, die Stöchiometrie der Reaktion und die Enthalpie ∆H. Die freie Enthalpie ∆G und die Entropie

∆S können anschließend daraus abgeleitet werden.

Isothermale Titrationskalorimetrie 165

6.3.3.1 Enthalpie

Der Betrag der Enthalpie der untersuchten Bindungsreaktion lässt sich, wie in Abbildung 35 zu sehen, direkt aus dem Kurvenschnittpunkt mit der y-Achse ablesen. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die durch ITC-Messungen bestimmte Enthalpie die gesamte Wärmetönung des kompletten Reaktionssystems darstellt. Sie enthält sowohl den Wärmeaustausch zwischen den reagierenden Molekülen, als auch die durch überlagerte Prozesse umgesetzte Wärmemenge.

Dies können zum Beispiel konformative Änderungen, Ionisierung von polaren Gruppen und Wechselwirkungen mit den anderen Pufferkomponenten sein. Um die Enthalpie der reinen Bindungsreaktion zu bestimmen, müssen diese Wärmemengen zuvor abgezogen werden.

6.3.3.2 Bindungskonstante

Bei der ITC handelt es sich um eine Methode für thermodynamische Messungen. Solche Messungen machen keinerlei Aussagen über die Kinetik einer Reaktion, sondern liefern lediglich Daten über energetische Änderungen der Reaktionspartner. Registriert wird also lediglich die Aufnahme bzw. Abgabe von Wärme. Um zu auswertbaren Ergebnissen zu kommen, ist es notwendig, dass bei Konzentrationen gearbeitet wird, bei denen ausreichende Mengen an Ligand, freiem Protein und Komplex vorhanden sind. Die verwendeten Konzentrationen müssen oberhalb der Dissoziationskonstanten des Komplexes liegen. Nur dann kann die resultierende sigmoidale Kurve ausgewertet werden. Zu hohe Konzentrationen resultieren in einem zu hohen c-Wert mit den weiter oben beschriebenen Folgen. Zu niedrige Konzentrationen entsprechen einem zu niedrigen c-Wert, was auch zu einem nicht auswertbaren Kurvenverlauf bezüglich der Bindungskonstanten führt.

6.3.3.3 Freie Enthalpie und Entropie

Da die Messung isotherm erfolgt, lässt sich unter Standardbedingungen nach der Bestimmung der Reaktionsenthalpie und der Bindungskonstanten auch die Änderung der freien Enthalpie und in der Folge die Entropieänderung mit Gleichung 19 berechnen:

Gleichung 19 ∆G=−R⋅T⋅lnK =∆H −T⋅∆S

Auch hier ist zu beachten, dass sich die gemessene Entropieänderung aus den Beiträgen des gesamten Systems zusammensetzt.

6.3.3.4 Stöchiometrie der Reaktion

Aus einer mittels einer ITC-Titration erhaltenen sigmoidalen Kurve lässt sich die Stöchiometrie der beobachteten Reaktion direkt ablesen. Voraussetzung hierfür ist, dass mit Konzentrationen oberhalb der Dissoziationskonstanten gearbeitet wird. Nur in diesem Fall ist der zur Bestimmung des Äquivalenzpunktes benötigte Sprung in der Titrationskurve deutlich zu sehen.

Im Dokument Theoretische und experimentelle Untersuchungen zur Inhibition des Enzyms Aldose Reduktase (Seite 158-166)