Endosomenfusionsassays mit Wildtypzellen sowie Vti1b-defizienten

aufwiesen, wurden für Endosomenfusionsassays eingesetzt. Als erstes wurde mit Präparationen von frühen Endosomen aus Wildtypzellen getestet, ob eine Fusion überhaupt stattfindet und ob sie sich mit dem Sulfhydrylgruppen-alkylierenden Reagenz N-Ethylmaleimid (NEM) inhibieren lässt. Wie auch in anderen Zelltypen beschrieben (HOLROYD, 2001) ist die Fusionsreaktion abhängig. Inkubation mit einem ATP-verbrauchenden System resultierte in vollständiger Fusionsinhibierung. Ebenfalls in

vollständiger Inhibierung resultierte die Vorbehandlung von PNS und Cytosol mit NEM (Abb.10).

Abb.10: Abhängigkeit der Fusionsreaktion von ATP und NEM

Frühe Endosomen-Präparationen von Wildtypzellen wurden benutzt, um einige Charakteristika der Fusionsreaktion in MEF zu testen. Die Fusionsansätze wurden in An- oder Abwesenheit von ATP (Balken 1 bzw.3), bzw. mit NEM vorbehandelt in Anwesenheit von ATP inkubiert (Balken 2). Die immunpräzipitierte HRP-Aktivität im Fusionsansatz mit ATP wurde als 100% Wert benutzt.

Die ATP-Abhängigkeit und die Inhibierung der Fusion durch NEM lässt den Schluss zu, dass es sich bei der gemessenen HRP-Aktivität tatsächlich um ein Maß für SNARE-vermittelte Endosomenfusion handelt.

Nun konnten weitere Versuche vorgenommen werden. Abb. 11 zeigt vier Fusionsreaktionen mit frühen und späten Endosomen jeweils aus Wildtyp- und Vti1b-defizienten Zellen, die gleichzeitig angesetzt und gemessen wurden. In der Grafik wurde die absolute HRP-Aktivität im Immunpräzipitat angegeben. Auch frühe Endosomen und späte Endosomen aus Vti1b-defizienten Zellen fusionierten untereinander. Die Vergleichbarkeit der Werte basiert auf den eingesetzten Proteinmengen von Avidin- und bHRP-markierten PNS, die immer 400 µg betrug. Betrachtet man die erhaltenen Werte aus dieser Sicht, könnte man behaupten, dass Wildtypzellen eine etwas höhere Fusionseffizienz haben als Vti1b-defiziente Zellen. Ebenfalls auffällig ist die vergleichsweise hohe Fusionseffizienz der späten Endosomen. Dieses Ergebnis wirft die Frage auf, ob bei den präparierten späten Endosomen eventuell noch frühe Endosomen

zur Fusionseffizienz beitragen, also ob die übernommenen Markierungszeiten für späte Endosomen die richtigen Zeiten für MEF sind. Versuche zur Klärung dieser Frage sind in Kapitel 3.6.4 zu finden.

Ein zusätzlicher Faktor ist die HRP-Aktivität genormt auf das pelletierbare HRP pro Assay, das sich bei jeder Präparation unterscheidet. Dieser Unterschied liegt unter anderem am jeweiligen Allgemeinzustand der Zellen. Je nachdem ob die Zellen in guter oder schlechter Kondition zum Zeitpunkt der Markierung sind, nehmen sie unterschiedliche Mengen von Marker auf und dementsprechend ist beim Vergleich von unterschiedlichen Zelllinien und Präparationen zu bedenken, dass eine höhere absolute HRP-Aktivität nicht unbedingt eine bessere Fusionsaktivität bedeutet. Genausogut könnte es auch sein, dass die Organellen einfach mehr detektierbaren Marker aufgenommen haben. Die PNS-Präparation ist auch wichtig. Hierbei entscheidet sich, wie groß der Prozentsatz fusionsfähiger Organellen im PNS ist. So wird deutlich, dass aufgrund von Variablen, welche am besten mit den Begriffen Zellkondition sowie präparatives Geschick zu beschreiben sind, es nicht möglich ist, Fusionseffizienzen von verschiedenen Präparationen miteinander zu vergleichen.

Abb.11: Fusionseffizienz von frühen und späten Endosomen von Wildtyp-MEF und Vti1b-defizienten Zellen

In der Grafik wird die pro Fusionsassay eingesetzte Proteinmenge zum Vergleich herangezogen.

EE: frühe Endosomen LE: späte Endosomen

Weitere Versuche haben gezeigt, dass selbst zwei Präparationen der gleichen Zelllinie und des gleichen Organells in der absoluten Fusionseffizienz nicht vergleichbar sind (Abb.12).

Abb.12: Sechs Endosomenfusionsassays mit drei verschiedenen Präparationen von frühen Endosomen aus Wildtyp-MEF

Bei gleichen Nummern handelt es sich um dieselbe Präparation. Die Assays wurden alle an verschiedenen Tagen angesetzt und ausgewertet. Die Varianz der Fusionseffizienz wird schon beim Vergleich identischer Präparationen deutlich.

Mit dem nachfolgend beschriebenen Experiment sollte untersucht werden, ob die Präparationen von späten Endosomen frei von frühen Endosomen sind. Da späte Endosomen nicht mit frühen Endosomen direkt fusionieren, sollte bei einer Kombination von Avidin-markierten frühen Endosomen mit bHRP-markierten späten Endosomen bzw.

bHRP markierten frühen Endosomen und Avidin-markierten späten Endosomen kaum Fusion nachweisbar sein. In Abb.13 kann man sehen, dass die Fusionseffizienz des gemischten Ansatzes von bHRP-markierten frühen Endosomen mit Avidin-markierten späten Endosomen (29%) höher als die Effizienz von später endosomaler Fusion (7,5%) ist. Das könnte bedeuten, dass die Präparationen von späten Endosomen mit frühen Endosomen verunreinigt sind, weswegen erneut die Frage aufgeworfen wird, ob die korrekten Markierungszeiten gewählt wurden.

Allerdings ist zu berücksichtigen, dass die späten Endosomen allein sowie der kombinierte Reaktionsansatz mit HRP-markierten späten Endosomen und Avidin-markierten frühen Endosomen nur 7,5 % Fusionseffizienz zeigen. Das deutet darauf hin, dass die HRP-markierten späten Endosomen fast inaktiv waren. Das Experiment wurde zwei mal wiederholt, jedoch war bei den Wiederholungen auch bei der Kontrolle nur mit frühen Endosomen eine Fusion nicht mehr nachweisbar. Der Grund für den Zusammenbruch des sensiblen Assays konnte bis zu diesem Zeitpunkt nicht herausgefunden werden.

Abb.13: Fusionsansätze zwischen verschiedenen Endosomen von Wildtypzellen

Je eine Präparation von frühen sowie späten Endosomen von Wildtyp-Zellen wurde entweder für normale Fusionsreaktionen oder für gemischte Fusionsreaktionen eingesetzt.

EE: frühe Endosomen LE: späte Endosomen Av: Avidin

3.2.5 Inhibierung der Fusion von frühen Endosomen mit affinitätsgereinigten