Zur Untersuchung der Toxizität wurde derCellTiter-Glo Luminescence Cell Viability Assay von Promega angewendet.[49] Es wurden jeweils 1 mg und 2 mg der drei gefriergetrockneten Biopolymere (i)reines Biopolymer, ii) vernetztes Biopolymer, iii) funktionalisiertes, vernetztes Biopolymer und iv) funktionalisiertes, bestrahltes und vernetztes Bioolymer) eingewogen, um 1 wt%- und 2 wt%-ige Lösungen im Zelltest herzustellen. Der Zelltest selbst wurde von Adriana Sobota durchgeführt.
Es wurden 50 000 A549-Lungenkrebszellen auf einer 96 -Well-Platte verwendet.
500 mLMedium bestanden aus Penicillin und Streptavidin (5 mL,1 %), FBS (fätales Kälberserum,50 mL), MEM NEAA (minimal essential medium, non-essincial Amino Acids, 100x,5 mL) und DNEM (Glukose, Glutamin, 1x,4.5 g/L). Es wurden je drei Wells mit100µLZellen im Medium als Positivprobe und mit50µLZellen im Medium zusammen mit50µL 1µMStaurosporin als Negativprobe befüllt. Weiterhin wurden drei Wells mit 100µL Medium befüllt. Es wurden 74 weitere Wells mit je 50µL Zellen im Medium befüllt. Die Well-Platte wurde für 24 h bei37◦Cund 5 %CO2 inkubiert. Die Gerüststrukturen wurden in die Wells überführt, wobei wegen der Elektrostatik der Proben außerhalb der Flow-Hood gearbeitet wurde. Da zu wenig Substanz angesetzt wurde, wurden zum Teil weniger als drei Proben pro Substanz verwendet. Tabelle 5.7 zeigt die Anzahl der angesetzten Proben.
Tabelle 5.7: Anzahl der Gerüststrukturen, welche dem Toxizitätstest unterzogen wurden (XL steht für vernetzt).
iii) Collagen XL Pra-CKFKFQF 2 1
iv) Collagen XL Pra-CKFKFQF UV 2
-i) Hyaluronat 3 3
ii) Hyaluronat XL 2 1
iii) Hyaluronat XL Pra-CKFKFQF 2 1
iv) Hyaluronat XL Pra-CKFKFQF UV 1 2
i) Agarose 3 3
ii) Agarose XL 3 3
iii) Agarose Pra-CEFEFQF 3 2
iv) Agarose Pra-CEFEFQF UV 3 3
Zu jeder mit Gerüststruktur versetzten Well wurden weitere50µLMedium hinzuge-fügt. Die Proben wurden weitere24 hbei37◦Cund5 %CO2inkubiert. Da außerhalb der Flow-Hood gearbeitet wurde, wurden die Wells auf Bakterien unter dem Lichtmi-kroskop untersucht, wobei keine Bakterien entdeckt wurden. Anschließend wurden jeweils100µLCellTiter-Glo-Reagenz, welches bereits angesetzt vorlag, zugegeben.
Die Proben wurden2 minauf einem Orbitalschüttler geschüttelt. Dieser befand sich in einem Kühlraum (5◦C). Um das Lumineszenzsignal zu stabilisieren, wurden die Proben10 min bei37◦Cund 5 %CO2 inkubiert. Die Lumineszenz wurde mithilfe einesGloMax Multi + MultiMode Readersder FirmaPromegagemessen. Dabei betrug die Messzeit2 s. Jede Probe wurde dreimal gemessen. Die Proben wurden nach der Messung dunkel im Kühlraum gelagert und nach weiteren24 h erneut gemessen, um die Ergebnisse erneut zu prüfen. Weiterhin wurden die Proben nochmals auf Bakterien untersucht, wobei auch diese Probe negativ ausfiel. Auch der pH-Wert der Lösungen wurde überprüft. Dieser lag bei allen Proben bei6.5.
5.7 Toxizitätstest der Biopolymere 73
6
Abbildung 6.1:IR-Spektrum von Collagen (schwarz), mit EDC und NHS vernetztem Collagen (rot), mit EDC und NHS vernetztem und mit Pra-CKFKFQF funktionalisiertem Collagen (grün) und mit EDC und NHS vernetzem, mit Pra-CKFKFQF funktionalisiertem
und mit UV-Licht behandeltem Collagen (blau).
75
4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0
Abbildung 6.2:IR-Spektrum von Agarose (schwarz), durch Erhitzen vernetzte Agarose (rot), mit Pra-CEFEFQF funktionalisierter Agarose (grün) und mit Pra-CEFEFQF
funktionalisierter und mit UV-Licht behandelter Agarose (blau).
4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0
Abbildung 6.3: IR-Spektrum von Hyaluronat (schwarz), mit BDDE vernetztem Hyaluronat (rot), mit BDDE vernetztem und mit Pra-CKFKFQF funktionalisiertem Hyaluronat (grün)
und mit BDDE vernetzem, mit Pra-CKFKFQF funktionalisiertem und mit UV-Licht behandeltem Hyaluronat (blau).
Diagramme des zweiten Toxizitätstests
u nt r ea t ed A5 49 l u ng ca nc er ce l ls
s t au r os po r in e 1 wt %
2 wt % X L 1 wt %
X L 2 wt %
X L Pr a -C KF KF QF 1w t% X L Pr a -C KF KF QF 2w t%
X L Pr a -C KF KF QF UV 1 wt %
0
1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 5 0 0 0 0 6 0 0 0 0 7 0 0 0 0 8 0 0 0 0 9 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0
Luminescence
C o l l a g e n
Abbildung 6.4:Toxizitätstest verschiedener Collagengerüste. Positivkontrolle: unbehandelte A549-Lungenkrebszellen, Negativkontrolle: Staurosporin. (XL steht für vernetzt).
77
u nt r ea te d A5 49
Abbildung 6.5: Toxizitätstest verschiedener Agarosegerüste. Positivkontrolle: unbehandelte A549-Lungenkrebszellen, Negativkontrolle: Staurosporin. (XL steht für vernetzt).
u nt r ea t ed A5 49
Abbildung 6.6: Toxizitätstest verschiedener Hyaluronatgerüste. Positivkontrolle:
unbehandelte A549-Lungenkrebszellen, Negativkontrolle: Staurosporin. (XL steht für vernetzt).
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Literatur 81
Abbildungsverzeichnis
1.1 Schematischer Verlauf des „Ice-Templatings“(XL steht für Vernetzung
(Cross-Linking), FD steht für Gefriertrocknung (Freeze-Drying)). . . 2
1.2 links: Schematische Darstellung zur Entstehung eines Temeraturgradi-enten, rechts: REM-Bilder von1 wt%-igem Collagen vom unteren Teil (e) und vom oberen Teil des Gerüstes (i).[16] . . . 4
1.3 Schematischer Aufbau eines Rasterelektronenmikroskops. . . 7
1.4 Farbskala des OrientationJ-Plugins. . . 8
3.1 Strukturformel von Pra-CKFKFQF. . . 14
3.2 Reaktionsgleichung der Thiol-Yne-Klick-Reaktion. . . 14
3.3 REM-Aufnahmen von6 wt%-igem Collagen links bei pH3 und rechts bei pH8-9 (Maßstab: oben100µm, Mitte50µmund unten20µm). . . 18
3.4 REM-Aufnahmen von Collagen nach der Gefriertrocknung bei verschie-denen Konzentratinen bei pH3. a)6 wt%, b)4 wt%, c)1 wt%, Maßstab: a)200µm, b,c)100µm. . . . 21
3.5 REM-Aufnahmen von Collagen gelöst in Essigsäure nach Gefriertrock-nung bei verschiedenen Konzentrationen. Maßstab:100µm, a)6 wt%, b)4 wt%, c)2 wt%, d)1 wt%. . . 22
3.6 REM-Aufnahmen verschiedener Füllhöhen von1 wt%-igem Collagen gelöst in Essigsäure nach dem Gefriertrocknen. Maßstab:100µm, a) 250µL, b)500µL, c)750µL d)1000µL. . . . 24
3.7 Schemata der beiden Gefäße (links: Gefäß 1, rechts: Gefäß 2). . . 25
3.8 REM-Aufnahme von 4 wt%-igem Collagen gelöst in Wasser mit pH3 nach dem Einfrieren mit Flüssigstickstoff und Gefriertrocknen in Gefäß 2. Maßstab:100µm. a) Originalaufnahme, b) Farbdarstellung erstellt mit ImageJ/Fijiplugin OrientationJ.[42] . . . 26
3.9 Vergleich verschiedener Einfriermethoden. REM-Aufnahmen von1 wt%-igem Collagen gelöst in Essigsäure nach der Gefriertrocknung. a,b) Gefrierschrank, −20◦C, c,d) Flüssigstickstoff (von unten), −196◦C und e,f) Eis-Kochsalz-Kältemischung (von unten),−10◦C, a,c,e) Ori-ginalaufnahme, b,d,f) Farbdarstellung erstellt mit ImageJ/Fijiplugin OrientationJ.[42] Maßstab: a,b)200µm, c-f)−100µm. . . . 28
83
3.10 REM-Aufnahmen von1 wt%-igem Collagen gelöst in Essigsäure nach dem Einfrieren mithilfe eines Peltier-Elements nach Gefriertrocknung.
Maßstab:200µm. a,b) kontrollierte Kühlrate, Polystyrol-Küvette, c,d) vorgekühltes Peltier-Element, Glas, a,c) Originalaufnahme, b,d) Farb-darstellung erstellt mit ImageJ/Fijiplugin OrientationJ.[42] . . . 29 3.11 Schemata des optimierten zweiten Gefäßes. . . 31 3.12 Vergleich verschiedener Einfriermethoden. REM-Aufnahmen von1
wt%-igen Collagenproben gelöst in Essigsäure nach dem Gefriertrocknen.
Maßstab:100µm, a) versilberter Draht, N2, b) Aluminium-Draht, Über-gießen mit N2zu Beginn, c) Aluminium-Draht, durchgehendes Über-gießen mit Aceton-Trockeneis-Mischung, d) Aluminium-Draht, durchge-hendes Übergießen mit N2 . . . 32 3.13 REM-Aufnahme von 1 wt%-igem Collagen gelöst in Essigsäure nach
dem Einfrieren über einen Aluminium-Draht, der permanent mit N2 übergossen wurde, und nach der Gefriertrocknung. Maßstab:100µm.
a) Originalaufnahme, b) Farbdarstellung erstellt mit ImageJ/Fijiplugin OrientationJ.[42] . . . 33 3.14 REM-Aufnahme von4 wt%-iger Agarose gelöst in Wasser mit pH3 nach
dem Einfrieren über einen Aluminium-Draht, der permanent mit N2 übergossen wurde, und nach der Gefriertrocknung. Maßstab:100µm.
a) Originalaufnahme, b) Farbdarstellung erstellt mit ImageJ/Fijiplugin OrientationJ.[42] . . . 34 3.15 REM-Aufnahme von1 wt%-igem Hyaluronat gelöst in Wasser mit
pH8-9 nach dem Einfrieren über einen Aluminium-Draht, der permanent mit N2 übergossen wurde, und nach der Gefriertrocknung. Maßstab:
100µm. a) Originalaufnahme, b) Farbdarstellung erstellt mit ImageJ/Fi-jiplugin OrientationJ.[42] . . . 34 3.16 Reaktion der Vernetzung von Collagen mit EDC und NHS. . . 35 3.17 Mechanismus der Vernetzung von Collagen mit EDC und NHS. . . 36 3.18 REM-Aufnahmen von1 wt%-igem Collagen nach Vernetzung mit NHS
und EDC und erneuter Gefriertrocknung. a) gelöst in Wasser pH3, eingefroren mit N2, Maßstab:20µmb) gelöst in Essigsäure, eingefroren im Gefrierschrank, Maßstab:100µm. . . . 37 3.19 REM-Aufnahmen von vernetzter4 wt%-iger Agarose gelöst Wasser mit
pH3 nach Gefriertrocknung unter Verwendung verschiedener Einfrier-methoden. Maßstab:100µm. (a) Schraubdeckelgefäß, von unten mit N2 eingefroren, (b) Gefäß 2 von unten mit N2 eingefroren und (c) Gefäß 2, über Aluminium-Drahtmit N2eingefroren. Dabei wurde die vernetzte Agarose jeweils von unten beziehungsweise über den Draht mit Flüssigstickstoff eingefroren. . . 38 3.20 Reaktion der Vernetzung von Hyaluronat mit BDDE. . . 39
3.21 REM-Aufnahmen von vernetztem4 wt%-igem Hyaluronat gelöst in Was-ser mit pH8-9 nach Einfrieren mit N2und Gefriertrocknung. Maßstab:
10µm. . . . 39 3.22 Reaktion der Funktionalisierung von Collagen mit Pra-CKFKFQF
mithil-fe von EDC und NHS. . . 40 3.23 REM-Aufnahmen von vernetztem und mit Pra-CKFKFQF
funktionali-siertem1 wt%-igem Collagen gelöst in Essigsäure nach dem Einfrieren im Gefrierschrank und der Gefriertrocknung. Maßstab100µm. a) ver-netzt und funktionalisiert b) verver-netzt und funktionalisiert, sowie im gefrorenen Zustand mit UV-Licht bestrahlt. . . 41 3.24 Reaktion der Funktionalisierung von Agarose mit Pra-CEFEFQF mithilfe
von DIC und DMAP. . . 42 3.25 Mechanismus der Funktionalisierung von Agarose mit Pra-CEFEFQF
mithilfe von DIC und DMAP. . . 43 3.26 REM-Aufnahmen von mit Pra-CEFEFQF funktionalisierter4 wt%-iger
Agarose gelöst in Wasser (pH3) nach dem Einfrieren in N2und der Ge-friertrocknung. Maßstab100µm. a) funktionalisiert b) funktionalisiert und im gefrorenen Zustand mit UV-Licht bestrahlt. . . 44 3.27 Reaktion der Funktionalisierung von Hyaluronat mit Pra-CKFKFQF
mithilfe von EDC und NHS. . . 45 3.28 Mechanismus der Funktionalisierung von Hyaluronat mit Pra-CKFKFQF
mithilfe von EDC und NHS. . . 46 3.29 REM-Aufnahmen von mit BDDE vernetztem und mit Pra-CKFKFQF
funk-tionalisiertem4 wt%-igem Hyaluronat gelöst in Wasser (pH8-9) nach dem Einfrieren in N2und der Gefriertrocknung. Maßstab: a,c,d)100µm, b,e,f)10µm. a,b) vernetzt und funktionalisiert c-f) vernetzt und funk-tionalisiert, sowie im gefrorenen Zustand mit UV-Licht bestrahlt, a-c,e) Originalaufnahme, d,f) Farbdarstellung erstellt mit ImageJ/Fijiplugin OrientationJ.[42] . . . 47 3.30 Toxizitätstest verschiedener Collagengerüste. Positivkontrolle:
unbe-handelte A549-Lungenkrebszellen, Negativkontrolle: Staurosporin. (XL steht für vernetzt). . . 48 3.31 Toxizitätstest verschiedener Agarosegerüste. Positivkontrolle:
unbehan-delte A549-Lungenkrebszellen, Negativkontrolle: Staurosporin. (XL steht für vernetzt). . . 49 3.32 Toxizitätstest verschiedener Hyaluronatgerüste. Positivkontrolle:
unbe-handelte A549-Lungenkrebszellen, Negativkontrolle: Staurosporin. (XL steht für vernetzt). . . 50
Abbildungsverzeichnis 85
6.1 IR-Spektrum von Collagen (schwarz), mit EDC und NHS vernetztem Collagen (rot), mit EDC und NHS vernetztem und mit Pra-CKFKFQF funktionalisiertem Collagen (grün) und mit EDC und NHS vernetzem, mit Pra-CKFKFQF funktionalisiertem und mit UV-Licht behandeltem Collagen (blau). . . 75 6.2 IR-Spektrum von Agarose (schwarz), durch Erhitzen vernetzte Agarose
(rot), mit CEFEFQF funktionalisierter Agarose (grün) und mit Pra-CEFEFQF funktionalisierter und mit UV-Licht behandelter Agarose (blau). 76 6.3 IR-Spektrum von Hyaluronat (schwarz), mit BDDE vernetztem
Hyaluro-nat (rot), mit BDDE vernetztem und mit Pra-CKFKFQF funktionalisier-tem Hyaluronat (grün) und mit BDDE vernetzem, mit Pra-CKFKFQF funktionalisiertem und mit UV-Licht behandeltem Hyaluronat (blau). . 76 6.4 Zweiter Toxizitätstest verschiedener Collagengerüste. Positivkontrolle:
unbehandelte A549-Lungenkrebszellen, Negativkontrolle: Staurosporin.
(XL steht für vernetzt). . . 77 6.5 Zweiter Toxizitätstest verschiedener Agarosegerüste. Positivkontrolle:
unbehandelte A549-Lungenkrebszellen, Negativkontrolle: Staurosporin.
(XL steht für vernetzt). . . 78 6.6 Zweiter Toxizitätstest verschiedener Hyaluronatgerüste.
Positivkontrol-le: unbehandelte A549-Lungenkrebszellen, NegativkontrolPositivkontrol-le: Stauro-sporin. (XL steht für vernetzt). . . 78
Tabellenverzeichnis
3.1 Präparation des RGDKIKIQIC. . . 13
3.2 Präparation des Pra-CKFKFQF. . . 15
3.3 Löslichkeit und Viskosität der Biopolymere Agarose, Alginat, Chitosan, Collagen, Dextran und Hyaluronat im sauren und alkalischen Milieu. . 16
3.4 Charakterisierung von Collagen nach dem Gefriertrocknen. . . 17
3.5 Vergleich der Biopolymere (die Löslichkeit* entspricht Löslichkeit nach der Gefriertrocknung). . . 20
5.1 Ausgangszustand der Pra-CKFKFQF-Proben. . . 58
5.2 Ansatz der Vernetzung von Collagen mithilfe von EDC und NHS. . . 66
5.3 Ansatz der Vernetzung von Hyaluronat mithilfe von BDDE. . . 68
5.4 Ansatz der Vernetzung von Collagen und Funktionalisierung mit Pra-CKFKFQF mittels EDC und NHS. . . 69
5.5 Ansatz der Funktionalisierung von Agarose mit Pra-CEFEFQF mithilfe von DMAP und DIC. . . 70
5.6 Ansatz der Vernetzung und Funktionalisierung von Hyaluronat mit Pra-CKFKFQF und BDDE. . . 71
5.7 Anzahl der Gerüststrukturen, welche dem Toxizitätstest unterzogen wurden (XL steht für vernetzt). . . 72
87