Einfluss der Wellenlänge, Leistungsdichte und Einwirkzeit der Laserstrahlung auf Chondrozytenkulturen

Die Chondrozyten spielen eine wichtige Rolle beim Aufbau des verlorengegangenen Gewebes im osteoarthrotischen Knorpel. Im Rahmen einer In-vitro-Untersuchung soll deshalb evaluiert werden, ob durch die Laserbestrahlung die Chondrozyten des osteoarthrotischen Knorpels zu einer gesteigerten Synthese der Matrix angeregt werden können. Weiterhin soll untersucht werden, welchen Einfluss Laserparameter wie Wellenlänge, Leistungsdichte und Bestrah-lungszeit auf das Verhalten der Chondrozyten in Chondrozytenkulturen nach deren Bestrahlung mit Laserlicht haben.

Mit Hilfe dieser Untersuchungen sollen Voraussetzungen für eine potenzielle Anwendung der Lasertherapie im Rahmen der Osteoarthrosebehandlung evaluiert werden. Zu diesem Zwecke wurden die dem humanen osteoarthrotischen Knorpel entnommenen Chondrozyten kultiviert und mittels verschiedener Lasersysteme bei Verwendung unterschiedlicher Laserparameter (Leistungsdichte und Expositionszeit) bestrahlt. Die dabei zu erwartenden Veränderungen der Matrixsynthese sollen durch Messungen der Radioaktivität vom ³H-Prolin quantifiziert werden.

Der humane osteoarthrotische Gelenkknorpel wurde im Rahmen der Gelenkendo-prothesenoperationen bei Cox- und Gonarthrose entnommen. Nach der Entnahme wurde der Gelenkknorpel sofort steril vom knöchernen Gelenkteil abgetrennt und in 4°C kaltes Kulturmedium transportiert. Vor ihrer Anwendung im Rahmen der geplanten Versuche wurden die Proben dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und danach 24 Stunden zur Erholung im Nährmedium inkubiert. Als Kulturmedium wurde Opti-MEM mit 15% FKS;

100 IE Penicillin, 100 μg Streptomycin und 2,5 μg Amphotericin B pro Milliliter verwendet. Die Kultivierung erfolgte in einem Inkubator bei 37°C und einer CO2-Konzentration von 5%.

24 Stunden nach der Entnahme wurden aus den Knorpelproben Zylinder mit einem Durchmesser von 4 mm gestanzt und in die Schalen einer 96er Lochplatte gegeben. Nach Zugabe von jeweils 250 μl frischem Kulturmedium wurden diese zur Erholung für weitere 24 Stunden inkubiert.

Jeweils eine Hälfte der Zylinder der entnommenen Knorpelproben wurde der Versuchsgruppe bzw. der Kontrollgruppe zugeordnet. Die Zylinder der Versuchsgruppe wurden bestrahlt mit Laserlicht. Vor der eigentlichen Laserbehandlung wurde das Nährmedium aus den Schalen entfernt und durch physiologische Kochsalzlösung ersetzt. Die Bestrahlung erfolgte mit dem Diodenlaser DL-12 (Toshiba) mit der Emissionswellenlänge von 690 nm sowie mit dem Nd:YAG-Laser Medilas 4060 (Dornier) mit der Emissionswellenlänge von 1064 nm. Die Bestrahlungsparameter beider Laser, die in den Versuchen eingesetzt wurden, sind in der Tabelle 2 dargestellt.

Der Austrittsstrahl des Diodenlaser war oval geformt und hatte eine Fläche von 0,1 cm². Beim Nd:YAG-Laser erfolgte die Laserbestrahlung über eine flexible Faser mit einem Kerndurchmesser von 400 μm. Während des Laservorganges waren die Knorpelzylinder 5 cm von der Austrittsfläche des Laserstrahls entfernt.

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Nach der Laserbestrahlung wurde die physiologische Kochsalzlösung aus Versuchs- und Kontrollgruppe entfernt und durch radioaktiv angereichertes Kulturmedium ersetzt. Es wurden zu jedem Stanzzylinder 250 μl Kulturmedium zugegeben. Dieses enthielt ³H-Prolin (Proline, L-[2,3-³H]/Du Pont) mit einer Radioaktivität von jeweils 2 μCi. Während der folgenden 24-stündigen Inkubationszeit waren die Knorpelkulturen in der Lage, Radioaktivität zu inkorporieren.

Tabelle 2: Laserparameter für die Bestrahlungsversuche an Chondrozytenkulturen

Versuchs-gruppe

Lasertyp Leistung Spotfläche Leistungs-dichte

Expositions-zeit

Energie- dichte

I Diodenlaser 20 mW 0,18 cm 0,1 W/cm 60 s 1,2 J

II Diodenlaser 20 mW 0,18 cm 0,1 W/cm 90 s 1,8 J

III Diodenlaser 20 mW 0,18 cm 0,1 W/cm 120 s 2,4 J

IV

Nd:YAG-Laser

2 W 0,13 cm 16 W/cm 0,5 s 1 J

V

Nd:YAG-Laser

2 W 0,13 cm 16 Wcm 60 s 120 J

VI

Nd:YAG-Laser

40 W 0,13 cm 318 W/cm 3 s 120 J

Zur Beendigung der radioaktiven Markierung wurde nach 24 Stunden das radioaktiv angereicherte Kulturmedium abgesaugt. Um unspezifisch gebundene Aktivität zu entfernen, wurden die Knorpelstanzzylinder anschließend dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung und einmal mit 100% Alkohol gewaschen. Danach wurden die Stanzzylinder für 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Es wurden jeweils vier Stanzzylinder zu einer Gruppe zusammengefasst.

Diese wurden gemeinsam gewogen und dann in ein Scintillationsvial für die Bestimmung des radioaktiven Uptakes gegeben.

Zu jeweils vier Knorpelzylindern pro Scintillationsvial (Super Poly Vial^®, 20 ml, Packard Instrument BV, Chemical Operations) wurden 250 μl physiologische Kochsalzlösung und 1 ml einer starken organischen Base, Soluene-350^® (Packard Instrument BV, Chemical Operations), zugeben. Die Hydrolyse erfolgte über 24 Stunden im Wasserbad bei 50°C. Nachdem das Gewebe vollständig aufgelöst war, wurden den Scintillationsvials 10 ml Hionic-Fluor^® (Packard Instrument BV, Chemical Operations) als Scintillationscocktail zugegeben.

Scintillationscocktails wandeln die beim radioaktiven Zerfall von -Strahlern entstehende Energie in Lichtblitze um. Diese Lichtblitze werden mit einem Liquid Scintillation Counter (LSC) registriert und als Maß für den radioaktiven Zerfall genommen. Die Radioaktivität der vier Knorpelzylinder pro Scintillationsvial wurden in einem LSC (1219 Rackbeta/Wallac) als relative Counts pro Minute (CPM) bestimmt.

In den Vorversuchen wurden folgende Bedingungen festgestellt:

1. Nach dem vierten Waschvorgang ließ sich kaum noch Aktivität in der Waschlösung

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nachweisen. Somit stammt die nach Hydrolyse gemessene Radioaktivität ausschließlich aus dem Knorpelgewebe.

2. Durch Messungen der Radioaktivität der Knorpelproben, die unter unterschiedlichen Kulturbedingungen inkubiert wurden (Standardbedingungen, Antibiotikalösung

und Alkohol) konnte festgestellt werden, dass die Abnahme der Radioaktivität als Zeichen einer Knorpelschädigung angesehen werden kann.

Nach Wägung von jeweils vier Knorpelstanzzylindern und Bestimmung der Radioaktivität wurden die CPM auf das Trockengewicht bezogen. Es ergaben sich somit 5 Messwerte in der Versuchsgruppe und 5 Messwerte in der Kontrollgruppe. Mittelwert und Standardabweichung der Messwerte von Versuchs- und Kontrollgruppe wurden bestimmt. Weiterhin wurde die Summe der Mittelwerte von Versuchs- und Kontrollgruppe berechnet.

67 Gruppe I

Die Menge der aufgenommenen Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Diodenlaser (Leistungsdichte 0,1 W/cm, Expositionszeit 60 s, Energie 1,2 J) ist in der Abb. 35 dargestellt.

Statistisch führte die Diodenlaserbestrahlung mit diesen Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% zu keiner Veränderung der Matrixsynthese beim Gesamtkollektiv der Patienten mit Osteoarthrose.

4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6

Knorpel gelasert

Knorpel Kontrolle

Patient

Abb. 35: Darstellung der Menge aufgenommener Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Diodenlaser (Leistungsdichte 0,1 W/cm, Expositionszeit 60 s, Energie 1,2 J). Der radioaktive Uptake ist in CPM/mg Trockensubstanz angegeben.

Der Knorpel von sechs Patienten aus der Gruppe I zeigte im Mittelwert nach Bestrahlung mit dem Diodenlaser eine um 104 CPM/mg Trockengewicht verminderte Einlagerung an Radioaktivität. Dies entspricht einer um 2,6% verminderten Aufnahme von ³H-Prolin gegenüber der unbestrahlten Kontrolle (Abb. 36).

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Abb. 36: Lasergruppe I. Durchschnittlich aufgenommene Radioaktivität in CPM/mg Trockengewicht der Knorpel aller 6 Patienten. Darstellung von mit dem Diodenlaser (Leistungsdichte 0,1 W/cm, Expositionszeit 60 s, Energie 1,2 J) bestrahlten Knorpel (A) und der Kontrollgruppe (B).

Gruppe II

Die Menge der aufgenommenen Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Diodenlaser (Leistungsdichte 0,1 W/cm, Expositionszeit 90 s, Energie 1,8 J) ist in der Abb. 37 dargestellt.

Statistisch führte die Diodenlaserbestrahlung mit diesen Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% zu keiner Veränderung der Matrixsynthese beim Gesamtkollektiv der Patienten mit Osteoarthrose.

6468 6364

6000 6100 6200 6300 6400 6500 6600 6700 6800 6900 7000

B A

69 2000

3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6

Knorpel gelasert Knorpel Kontrolle

Patient

Abb. 37: Lasergruppe II. Darstellung der Menge aufgenommener Radioaktivität in

Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Diodenlaser (Leistungsdichte 0,1 W/cm, Expositionszeit 90 s und Energie 1,8 J. Der radioaktive Uptake ist in CPM/mg Trockengewicht angegeben.

Der Knorpel von sechs Patienten aus der Gruppe II zeigte im Mittelwert nach Bestrahlung mit dem Diodenlaser eine um 43 CPM/mg Trockengewicht erhöhte Einlagerung an Radioaktivität.

Dies entspricht einer um 0,7% erhöhten Aufnahme von ³H-Prolin gegenüber der unbestrahlten Kontrolle (Abb. 38).

Abb. 38: Lasergruppe II. Durchschnittlich aufgenommene Radioaktivität in CPM/pro mg Trockengewicht der Knorpel aller 6 Patienten. Darstellung von mit dem Diodenlaser (Leistungsdichte 0,1 W/cm, Expositionszeit 90 s, Energie 1,8 J) bestrahlten Knorpel (A) und Kontrollgruppe (B).

5668 5625

5000 5100 5200 5300 5400 5500 5600 5700 5800 5900 6000

B A

70 Gruppe III

Die Menge der aufgenommenen Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Diodenlaser (Leistungsdichte 0,1 W/cm, Expositionszeit 120 s, Energie 2,4 J) ist in der Abb. 39 dargestellt.

Statistisch führte die Diodenlaserbestrahlung mit diesen Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% zu keiner Veränderung der Matrixsynthese beim Gesamtkollektiv der Patienten mit Osteoarthrose.

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000

Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6

Knorpel gelasert Knorpel Kontrolle

Patient

Abb. 39: Lasergruppe III. Darstellung der Menge aufgenommener Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Diodenlaser (Leistungsdichte 0,1 W/cm, Expositionszeit 120 s und Energie 2,4 J). Der radioaktive Uptake ist in CPM/mg Trockengewicht angegeben.

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Der Knorpel von sechs Patienten aus der Gruppe III zeigte im Mittelwert nach Bestrahlung mit dem Diodenlaser eine um 89 CPM/mg Trockengewicht erhöhte Einlagerung an Radioaktivität.

Dies entspricht einer um 1,5% erhöhten Aufnahme von ³H-Prolin gegenüber der unbestrahlten Kontrolle (Abb. 40).

Abb. 40: Durchschnittlich aufgenommene Radioaktivität in CPM/mg Trockengewicht der Knorpel aller 6 Patienten. Darstellung von mit dem Diodenlaser (Leistungsdichte 0,1 W/cm, Expositionszeit 120 s und Energie 2,4 J) bestrahlten Knorpel und Kontrollgruppe.

5477 5566

5000 5100 5200 5300 5400 5500 5600 5700 5800 5900 6000

B A

72 Gruppe IV

Die Menge der aufgenommenen Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Nd:YAG-Laser (Leistungsdichte 16 W/cm, Expositionszeit 0,5 s, Gesamtenergie 1 J) ist in der Abb. 41 dargestellt.

Statistisch führte die Diodenlaserbestrahlung mit diesen Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% zu keiner Veränderung der Matrixsynthese beim Gesamtkollektiv der Patienten mit Osteoarthrose.

4000 5000 6000 7000 8000

Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6

Knorpel gelasert Knorpel Kontrolle

Patient

Abb. 41: Lasergruppe IV. Darstellung der Menge aufgenommener Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Nd:YAG-Laser (Leistungs-dichte 16 W/cm², Expositionszeit 0,5 Sekunden, Energie 1 J). Der radioaktive Uptake ist in CPM/mg Trockengewicht angegeben.

Der Knorpel von sechs Patienten aus der Gruppe IV zeigte im Mittelwert nach Bestrahlung mit dem Nd:YAG-Laser eine um 168 CPM/mg Trockengewicht erhöhte Einlagerung von Radioaktivität. Dies entspricht einer vermehrten Aufnahme von ³H-Prolin um 3% gegenüber der unbestrahlten Kontrolle (Abb. 42).

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Abb. 42: Lasergruppe IV. Durchschnittlich aufgenommene Radioaktivität in CPM/mg Trockengewicht der Knorpel aller 6 Patienten. Darstellung von mit dem Nd:YAG-Laser (Leistungsdichte 16 W/cm², Expositionszeit 0,5 s, Energie 1 J) bestrahlten Knorpel (A) und Kontrollgruppe (B).

Gruppe V

Die Menge der aufgenommenen Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Nd:YAG-Laser (Leistungsdichte 16 W/cm, Expositionszeit 60 s, Gesamtenergie 120 J) ist in der Abb. 43 dargestellt.

Statistisch führte die Diodenlaserbestrahlung mit diesen Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% zur gesteigerten Matrixsynthese beim Gesamtkollektiv der Patienten mit Osteoarthrose.

B A

74

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6

Knorpel gelasert Knorpel Kontrolle

Patient

Abb. 43: Lasergruppe V. Darstellung der Menge aufgenommener Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Nd:YAG-Laser (Leistungsdichte 16 W/cm², Expositionszeit 60 s, Energie 120 J).

Der radioaktive Uptake ist in CPM/mg Trockengewicht angegeben.

Der Knorpel von sechs Patienten aus der Gruppe V zeigte im Mittelwert nach Bestrahlung mit dem Nd:YAG-Laser eine um 471 CPM/mg Trockengewicht erhöhte Einlagerung an Radioaktivität. Dies entspricht einer um 9,5% erhöhten Aufnahme von ³H-Prolin gegenüber der unbestrahlten Kontrolle (Abb. 44).

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Abb. 44: Lasergruppe V. Durchschnittlich aufgenommene Radioaktivität in CPM pro mg Trockengewicht der Knorpel aller 6 Patienten. Darstellung von mit dem Nd:YAG-Laser (Leistungsdichte 16 W/cm², Expositionszeit 60 s, Energie 120 J) bestrahlten Knorpel (A) und Kontrollgruppe (B).

Gruppe VI

Die Menge der aufgenommenen Radioaktivität in Versuchs- und Kontrollgruppe bei 6 verschiedenen Patienten nach Bestrahlung mit dem Nd:YAG-Laser (Leistungsdichte 318 W/cm, Expositionszeit 3 s, Gesamtenergie 120 J) ist in der Abb. 45 dargestellt.

Statistisch führte die Diodenlaserbestrahlung mit diesen Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% zu einer verkleinerten Matrixsynthese beim Gesamtkollektiv der Patienten mit Osteoarthrose.

4974 5445

4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 5400 5600 5800 6000

B A

76 3000

4000 5000 6000 7000 8000 9000

Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6

Knorpel gelasert Knorpel Kontrolle

Patient

Abb 45: Lasergruppe VI. Darstellung der Menge aufgenommener Radioaktivität in Versuchs-

Im Dokument Neue Ansätze zur Knorpelgeweberestitution durch selektiven Wärmeeintrag mittels Laserstrahlung (Seite 65-77)