Einfluss von Antikoagulanzien auf die Eap-induzierte Thrombozytenaktivierung

II. Material und Methoden 55

Diese Partikel können ebenfalls qualitativ und quantitativ anhand von spezifisch bindenden Antikörpern und ihrer geringen Größe durchflusszytometrisch erfasst werden. Hier erfolgte der Nachweis der Mikropartikel mit Hilfe des Thrombozyten-spezifischen Antikörpers anti-CD42a-FITC (Klon Beb1). So konnten andere Fremdpartikel von den Thrombozyten und den Mikropartikeln differenziert werden.

Für diesen Versuch wurden GFP mit H/T-Puffer (+ 6 mM CaCl2) auf 25.000 Tz/µl eingestellt.

Das Eap wurde in den bisher genutzten Konzentrationen in die Probenröhrchen vorgelegt und jeweils 100 µl des GFP-Ansatzes dazupipettiert. Die Proben wurden für 20 min bei Raumtemperatur massiv geschüttelt, daraufhin mit je 5 µg/ml anti-CD42a-FITC versehen und für 15 min bei leichtem Schwenken, Raumtemperatur und Dunkelheit inkubiert. Bevor sie durchflusszytometrisch gemessen wurden, wurde noch einmal 500 µl H/T-Puffer hinzugefügt.

Anhand der FSC-Signalstärke konnten die intakten Zellen und die gebildeten Mikropartikel in jeweils ein „Gate“ eingegrenzt und differenziert werden; auch der jeweils prozentuale Anteil ist damit zu berechnen.

Lösungen:

-Hepes/Tyrode (H/T)-Puffer: siehe II.4.1

(pH 7,4) hier mit Zusatz von CaCl2: 6 mM

II.7 Einfluss von Antikoagulanzien auf die Eap-induzierte

bereits in den kommerziellen Blutabnahmeröhrchen vor und wurden in diesen Versuchen ebenfalls in dieser Form genutzt.

Lösungen:

-Tri-Natriumcitrat-Stammlösung: 110 mM

-Kalium-EDTA-Stammlösung: 1,6 mg/ml

II.7.2 Hirudin

Dieses Polypeptid stammt aus dem medizinischen Blutegel (Hirudo medicinalis) und hat anti-koagulatorische Eigenschaften; heute wird der Thrombininhibitor synthetisch hergestellt. Die Primärstruktur der Hirudinvariante-1 besteht aus 65 Aminosäuren und ist damit ein relativ kleines Protein mit ca. 7.000 Da.

Hirudin bindet an die Fibrinogenbindungsstelle des Thrombins, hemmt damit das aktive Zentrum der Serinprotease und somit die Fibrinogenspaltung zu Fibrin. Es wird vor allem bei Patienten mit HIT-Typ II eingesetzt.

Nachteile dieses Antikoagulanz sind, dass es die Plazentaschranke passieren kann und auch in die Muttermilch gelangt. Außerdem muss bei Hirudin, wie auch bei Heparinen und Vitamin K - Antagonisten, ein frequentes Monitoring der Gerinnungsparameter erfolgen, und es gibt für Hirudin kein spezifisches Antidot.

Das Lepirudin (Refludan® von Pentapharm, Basel (CH)) wurde mit einer Konzentration von 5 U/ml in das Blutabnahmeröhrchen vorgelegt.

Lösung:

-Hirudin-Stammlösung: Wirkstoff: Lepirudin (Hirudin-1) 250 U/ml

II.7.3 Melagatran

Melagatran ist ein direkter Thrombin-Inhibitor, der an die enzymatisch aktive Molekülregion des löslichen und thrombusgebundenen α-Thrombins bindet. Durch diese reversible Bindung verhindert es sowohl die thrombinvermittelte Aktivierung der Gerinnungsfaktoren als auch die Fibrinogenspaltung zu Fibrin.

Ursprünglich sollte es Warfarin, Aspirin und Heparin ersetzen, die zur Prophylaxe und Behandlung von thromboembolischen Komplikationen eingesetzt werden.

Ein Vorteil von Melagatran wäre die orale Einnahme, mit einer konstanten Dosis und schnellem Wirkungseintritt, ohne dass die Gerinnungsparameter hätten überwacht werden müssen.

II. Material und Methoden 57

Ein Nachteil von Melagatran wäre, dass kein Antidot vorhanden ist. Außerdem traten bei einer Langzeit-Therapie unerwünschte Nebenwirkungen in Form von Leberschäden auf, deren Mechanismus bisher allerdings ungeklärt bleibt. Somit ist es zurzeit nur als Kurzzeitprophylaxe gegen venöse Thromboembolien zugelassen, die sich häufig nach orthopädischen Operationen entwickeln.

In diesem Versuch wurde dem Blutabnahmeröhrchen Melagatran-Injektionslösung (AstraZeneca (London, GB)) mit einer Konzentration von 1,5 µM hinzugefügt.

Lösung:

-Melagatran-Injektionslösung: 23,3 mM

oder 3,0 mg/0,3 ml

II.7.4 Heparine

Es gibt zwei Arten des Heparins: unfraktioniertes Heparin (UFH) und niedermolekulares Heparin (NMH). Für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen sind es unentbehrliche Arzneistoffe.

Das UFH ist aus Mukopolysaccharid-Ketten aufgebaut und variiert stark in seinem Molekulargewicht (3.000-30.000 Da); es besitzt eine Kettenlänge von 18 oder mehr Monosacchariden. Das NMH wird durch chemische und enzymatische Spaltung aus dem UFH hergestellt, welches dann ein mittleres Molekulargewicht von 4.000-5.000 Da und eine Kettenlänge von fünf bis siebzehn Monosacchariden aufweist.

Die anti-thrombotische Wirkung des Heparinmoleküls wird vor allem durch die Pentasaccharidsequenz aus Iduronsäure-Glukosamin-Glukuronsäure vermittelt. Als Substituenten sind häufig die Sulfatgruppen der Iduronsäure und des Glukosamins, sowie das N-acetylierte D-Glukosamin vorhanden. Diese Substituenten in der Pentasaccharidsequenz - auch „high-affinity-region“ genannt - verstärken die negative Ladung des Heparinmoleküls und erleichtern so dessen Anlagerung an positiv geladene Lysingruppen des Antithrombins, wodurch dieses aktiviert wird.

Für eine Hemmung des Thrombins ist die Bildung dieses Komplexes aus Antithrombin, Thrombin und Heparin notwendig, dagegen reicht für die Inaktivierung von FIXa und Xa die Bindung von Heparin an Antithrombin aus.

UFH bildet aufgrund seiner Größe und seiner negativen Ladung Komplexe mit Kationen und hat so neben der direkten Gerinnungshemmung auch eine indirekte Wirkung. Die Interaktion zwischen Thrombozyten und Endothelzellen wird stimuliert, so dass aus Letzteren der TFPI und das antikoagulatorisch wirksame Heparansulfat freigesetzt werden.

Außerdem wird t-PA („tissue plasminogen activator“) aus den Endothelzellen freigesetzt, welches die Fibrinolyse induziert.

Bei der Behandlung mit Heparin treten auch unerwünschte Nebenwirkungen auf, wie die Heparin induzierte Thrombozytopenie (HIT), Osteoporose und allergische Reaktionen. Es werden zwei Formen der HIT unterschieden:

HIT Typ I ist die nicht-immunologische Form, induziert durch die direkte Bindung von Heparin an den Thrombozyten. HIT Typ I ist auch von geringerer Relevanz, da sich die Thrombozytenzahlen bei Fortsetzung der Therapie wieder normalisieren.

HIT Typ II dagegen ist immunologisch bedingt und wird durch Antikörper verursacht, die gegen den Komplex aus Heparin und PF4 gebildet werden, die zusammen ein Neoantigen bilden. Die Antikörper lagern sich an den FcγRIIa-Rezeptoren von aktivierten Thrombozyten an und verknüpfen diese mit dem Neoantigen, mit massiver Thrombozytenaktivierung.

Durch die nachfolgende Aggregation werden Massen von Thrombozyten verbraucht mit der Folge einer Thrombozytopenie.

In ein Blutabnahmeröhrchen wurden 20 U/ml an NMH (Fragmin®, Pfizer (Berlin)) vorgelegt und in ein weiteres 5 I.E./ml Blut an UFH (Heparin-Natrium®, ratiopharm (Ulm)).

Lösungen:

-Fragmin® -Stammlösung: Wirkstoff: Dalteparin-Natrium 250 U/ml

-Heparin-Natrium® -Stammlösung: 5.000 I.E./ml Injektionslösung

II.8 Einfluss von thiolreaktiven Substanzen auf die Eap-induzierte